尖吻蝮蛇毒口服的抗栓作用研究

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蛇毒的主要成分是生物活性多肽和蛋白质,约占干重的90％至95%。蛇毒属于特殊中药,主要成分为多肽或蛋白质,蛇毒制剂口服时能否吸收,活性组分吸收能否达到有效浓度水平,历来都是学术争论的焦点之一。因此,尖吻蝮蛇毒口服是否具有抗血栓作用及其机制如何,临床用药剂量应为多少才合理等均不得而知。本课题拟观察尖吻蝮蛇毒(agkistrodonacutusvenom,AAV)口服对动物实验性血栓预防和治疗作用及其机制,旨在为其进一步的研发提供实验资料。
　　1.小鼠口服AAV的急性毒性测定
　　成年健康昆明种小鼠,尖吻蝮蛇毒一次性灌胃,按Bliss法得出小鼠口服AAV的半数致死量LD50值为640±171mg·kg-1。根据小鼠LD50值,按照体表面积法推算出大鼠LD50近似值为301mg·kg-1。以LD50和预实验的结果作为大鼠和小鼠口服AAV的剂量的依据,将以40和80mg·kg-1(约为LD50的1/8-1/4)作为大鼠给药剂量,以60和120mg·kg-1(约为LD50的1/10-1/5)作为小鼠给药剂量。
　　2.AAV口服对大鼠凝血功能的影响
　　手工法测定大鼠活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)。结果大鼠igAAV40和80mg·kg-1均能明显延长APTT时间,AAV40和80mg·kg-1APTT分别为48.8±12.79s和42.0±8.40s,与生理盐水组的23.6±6.11s比较有极显著差别(p<0.01)和显著差别(p<0.05)。PT分别为18.0±6.82s和12.4±1.34s,与生理盐水组的12.2±3.27s比较无显著性差别。TT分别为23.2±27.5s和22.6±22.4s,与生理盐水组的15.4±14.2s比较无显著性差别。由此可知,AAV在体内通过抑制内源性凝血途径发挥抗凝作用。
　　3.AAV口服对ADP-Na2诱导的小鼠急性肺栓塞的影响
　　采用ADP-Na2诱导小鼠急性肺栓塞模型,由于ADP诱导血小板聚集形成微小血栓,血流经肺动脉时,造成肺动脉的微栓塞,出现呼吸窘迫症,小鼠出现呼吸困难、翻正反射消失等症状,小鼠呼吸喘促的时间长短反映了栓塞的程度。AAV口服明显缩短小鼠呼吸喘促的时间,AAV60和120mg·kg-1组其喘促时间分别为28.00±6.07s和37.38±6.09s,与模型组59.13±8.08s比较均有极显著差别(p<0.01),AAV组与阿司匹林组的45.75±9.88s比较也有极显著差别(p<0.01)和显著差别(p<0.05),说明AAV缩短小鼠呼吸喘促时间短于阿司匹林。与模型组比,HE染色给药低高剂量组肺微血栓数均明显减少。说明AAV可明显缩短ADP诱导的血小板聚集性肺栓塞引起呼吸喘促的时间,同时使肺栓塞病灶内的微血栓数减少,提示AAV在体内对ADP-Na2诱导的血小板聚集具有抑制作用。
　　4.AAV口服对大鼠颈动静脉(A—V)回路形成的血小板性血栓的影响
　　在大鼠颈动静脉旁路循环中,当血流中的血小板接触丝线粗糙面时,发生黏附、聚集效应,血小板聚集物环绕丝线表面形成血栓。大鼠igAAV40和80mg·kg-1能明显减轻血栓重量,AAV40和80mg·kg-1组血栓重量分别为31.98±1.04mg和27.48±0.77mg,阿司匹林组为28.13±2.76mg,与生理盐水组52.61±2.07mg比较均有显著差别(p<0.01)。说明AAV口服对血小板性动脉血栓的形成具有明显抑制效应。
　　5.AAV口服对凝血酶诱导的大鼠下腔静脉血栓形成的影响
　　凝血酶能催化血液中的纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白,诱导下腔静脉后血栓形成。大鼠igAAV40和80mg·kg-1能明显减轻凝血酶诱导的大鼠下腔静脉血栓重量,AAV40和80mg·kg-1组血栓重量分别为55.08±2.56mg和35.53±2.52mg,蚓激酶组为34.36±4.22mg,与生理盐水组72.53±3.09mg比较均有显著差别(p<0.01)。说明AAV口服可预防大鼠下腔静脉血栓的形成。
　　6.AAV口服对角叉菜胶诱导的小鼠尾部混合血栓的影响
　　角叉菜胶能引起炎症损伤血管内皮细胞,激活外源性凝血系统,造成尾部混合血栓的形成。小鼠igAAV60和120mg·kg-1组血栓形成率分别为75%和66%,阿司匹林组为60%,与生理盐水组80%比较未见明显差异。小鼠igAAV60和120mg·kg-1组尾部血栓形成相对长度分别为0.23±0.15cm和0.11±0.10cm,阿司匹林组为0.13±0.12cm,AAV120mg·kg-1组与生理盐水组0.28±0.15cm比较有显著差别(p0.05)。说明AAV能明显预防和治疗小鼠尾部混合血栓且无明显毒副作用。
　　7.AAV口服对血浆优球蛋白溶解时间(euglobulinlysistime,ELT)影响
　　通过化学法测定大鼠血浆ELT,大鼠igAAV40和80mg·kg-1组能明显缩短优球蛋白凝块溶解时间,口服40和80mg·kg-1组的ELT分别为342±34.2min和360±56.1min,与生理盐水组(>1440min)比较均有显著差别(p<0.01)。说明AAV在体内能激活纤溶系统,发挥抗血栓作用。
　　8.AAV口服对组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)含量的影响
　　组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)与已形成血栓的纤维蛋白、纤溶酶原结合为三体复合物,诱导纤溶酶原成为纤溶酶,溶解血块,发挥选择性溶栓作用。采用Elisa法测定大鼠血浆中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的含量,大鼠igAAV40和80mg·kg-1组血浆中t-PA含量明显升高,分别为207.4±46.38pg·ml-1和375.6±97.92pg·ml-1,与生理盐水组125.3±18.21pg·ml-1比较有显著差别(P<0.05)和极显著差别(P<0.01)。说明AAV能通过升高t-PA浓度激活纤溶酶原形成纤溶酶而提高纤溶系统活性。
　　9.大鼠尖吻蝮蛇毒含药血清的体外纤溶活性测定
　　采用纤维蛋白平板法测定大鼠口服AAV含药血清的纤溶活性。在加热纤维蛋白平板上,大鼠口服AAV40和80mg·kg-1含药血清的溶解圈面积分别为14.76mm2和24.22mm2,均大于大鼠口服LK50mg·kg-1含药血清的溶解圈面积12.87mm2,给药组溶解圈面积均明显大于生理盐水组5.42mm2。在普通纤维蛋白平板上,大鼠口服AAV40和80mg?kg-1含药血清的溶解圈面积分别为64.97mm2和98.81mm2,大鼠口服LK50mg?kg-1含药血清的溶解圈面积为78.12mm2,给药组溶解圈面积均大于生理盐水对照组溶解圈面积2.91mm2。
　　10.大鼠尖吻蝮蛇毒含药血清对血块溶解时间(BLT)的影响
　　大鼠口服AAV40和80mg·kg-1含药血清对血块的溶解率随给药剂量的增加而增大,血块湿重明显减小。AAV40和80mg·kg-1组溶解率分别为19.23±0.05和21.27±0.02,与生理盐水组14.14±0.05比较有显著差别(P<0.05)和极显著差别(P<0.01)。说明AAV含药血清在体外能明显溶解血块。
　　结论:AAV口服能使活化部分凝血活酶时间明显延长,优球蛋白溶解时间明显缩短,t-PA含量明显升高。AAV口服对大鼠实验性动、静脉血栓均有预防作用,能预防小鼠尾静脉混合血栓的形成并促进其消退。AAV在体内对ADP诱导的急性肺栓塞综合征有明显缓解作用。AAV含药血清在体外能增加血块的溶解率。

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作者
林中月;
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作者单位

福建医科大学;

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授予单位福建医科大学;
学科药理学
授予学位硕士
导师姓名许云禄;
年度 2013
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正文语种中文
中图分类中药临床药理;心血管系统药物;
关键词
尖吻蝮蛇毒; 抗栓作用; 凝血功能; 组织型纤溶酶原激活剂; 动物模型;

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