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两种延迟整流钾通道离子流相互作用的研究

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第一部分 磁珠标记法测定共转染后 KCNQ1/KCNE1 通道电流

一、材料与方法：

二、结果

三、讨论

第二部分 WT-KCNQ1/KCNH2 通道的电生理特征的研究及比较

一、材料与方法：

二、结果

三、讨论

参考文献

致谢

心脏钾通道各离子流间相互作用的研究进展

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摘要

背景和目的:
　　延迟整流钾离子通道(如IKr和IKs)同一通道的不同亚基与不同通道间均存在相互作用。通过研究IKs通道内部亚基间不同比例组合的相互作用,比较KCNQ1/KCNE1电流与野生型的IKs电流的电生理特性。对比共转染的KCNQ1/KCNH2通道与野生型KCNQ1通道及KCNH2通道的电流特征,以进一步揭示心律失常的发病基础,为其临床用药提供理论依据。
　　第一部分磁珠标记法测定共转染后KCNQ1/KCNE1通道电流
　　方法:
　　利用免疫磁珠阳性标记法制作KCNQ1/KCNE1通道表达系统,测定通道电流的I-V曲线、稳态激活曲线和激活时间常数等,比较其与WT-KCNQ1通道电流的区别,探讨KCNQ1/KCNE1通道亚基间不同比例组合时的电流特性。
　　结果:
　　采用35mm平皿,2ug质粒,5ul lipofectamine转染试剂,在48-72h时细胞阳性率可达10~15％。记录KCNQ1/KCNE1通道电流,比较亚基间不同比例组合下电流密度,在比例达到1:3时达到高峰;稳态激活曲线与波尔兹曼方程良好拟合,V1/2及斜率(k)均比WT-KCNQ1通道的值大;灭活时间常数Tau1和Tau2均较大,灭火时间长;KCNQ1/KCNE1(1:3)通道的激活时间常数Tau值随着电压的增加而不断增大。
　　结论:
　　1.细胞最佳的转染配比为2ug质粒,5ul lipofectamine转染试剂,当KCNQ1:KCNE1比例为1:3时,此组合的电流与经典的Iks电流最接近。
　　2.所记录的KCNQ1/KCNE1通道(α:β=1:3)电流密度比WT-KCNQ1通道大,说明KCNE1通道蛋白的表达量与IKs电流密度成正比。
　　3.KCNQ1/KCNE1通道门控动力学特性与WT-KCNQ1通道完全相反,却与经典的Iks电流一致,即表现出慢激活、慢灭火和基本上无失火的电流特征。
　　4.电流密度和门控动力学的改变与KCNQ1/KCNE1通道内部亚基间相互作用密不可分。
　　第二部分WT-KCNQ1/KCNH2通道的电生理特征的研究及比较
　　方法:
　　利用免疫磁珠阳性标记表达系统记录WT-KCNQ1/KCNH2通道电流,分别比较其与WT-KCNQ1通道及WT-KCNH2通道电流的区别,揭示不同延迟整流钾通道间的相互作用,及与心律失常的发生机制相关。
　　结果:
　　KCNQ1/KCNH2通道在KCNQ1通道蛋白的作用下电流密度均明显增加,且在刺激电压20mV以上时出现明显的内向整流特性;当刺激电位为-40mV~+60mV系列脉冲刺激时,通道稳态激活曲线与波尔兹曼方程拟合效果良好,其V1/2=-0.92331±2.22338mV,k=9.58502±2.03137mV;在20mV时激活时间常数Tau值开始迅速下降,这与其峰值电流的I-V曲线相吻合。
　　结论:
　　1.KCNQ1/KCNH2钾通道的电流密度比野生型的大,但未改变其内向整流特性。说明KCNQ1通道蛋白的协同作用,能明显改变KCNH2通道电流的曲线形状和峰值。
　　2.KCNQ1/KCNH2钾通道的稳态激活曲线与波尔兹曼方程拟合效果良好,灭火时间常数和激活时间常数明显较单独的野生型通道大。
　　3.共转染后通道的动力学改变说明钾通道的不同通道(IKs和IKr)间电流存在相互作用、相互影响。

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