携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建与表征

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

目的:
　　构建沉默人survivin基因的siRNA真核表达载体,采用聚乙烯亚胺胆固醇衍生物将载体连接到脂质微泡,并对微泡进行靶向修饰,使其与乳腺癌细胞膜表面HER-2抗原特异性结合,探索一种新型的乳腺癌RNA干扰治疗基因转染工具。
　　方法:
　　1.采用免疫荧光法检测乳腺癌细胞膜表面HER-2抗原;采用机械振荡法制备脂质微泡,生物素-亲和素桥接法将靶向乳腺癌细胞膜表面抗原HER-2抗体赫赛汀连接到脂质微泡上,观察微泡的形态、密度、粒径及分布范围,并考察其与表达HER-2的乳腺癌细胞SK-BR-3特异性结合的能力。
　　2.设计合成靶向人survivin基因的发夹结构的siRNA模板,克隆至真核表达载体pGPU6/GFP/Neo,构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-survivin,转化感受态细胞TOP10菌株,扩增并提取质粒,对重组质粒进行酶切鉴定、序列测定。
　　3.以聚乙烯亚胺、胆固醇甲酰氯为原料合成阳离子脂质PEI-Chol,琼脂糖凝胶电泳阻滞试验检测不同N/P比对PEI-Chol结合质粒DNA能力及PEI-Chol/DNA复合物抗核酸酶DNase I酶解的能力。
　　4.采用反相蒸发-机械振荡法制备载siRNA真核表达载体的脂质微泡,生物素-亲和素桥接法将赫赛汀抗体偶联到脂质微泡,构建携siRNA真核表达载体的靶向微泡,显微镜观察微泡的形态、密度、粒径及分布范围,观察载基因靶向微泡与乳腺癌细胞SK-BR-3的结合能力。
　　结果:
　　1.免疫荧光结果显示,SK-BR-3细胞可与赫赛汀结合发出绿色荧光,而MDA-MB-231未见荧光;采用机械振荡法制备的脂质微泡分散良好,粒径分布较均匀,平均粒径为(3.1±0.7)μm,密度为1.6×108/ml,生物素-亲和素桥接法成功将赫赛汀偶联到脂质微泡;靶向脂质微泡微泡特异性结合到表达HER-2的SK-BR-3细胞。
　　2.靶向survivin的siRNA成功克隆到pGPU6/GFP/Neo质粒载体,重组载体可被限制性内切酶BamHI切开,而不能被BbsI切开,基因测序证实为survivin siRNA的真核表达载体。
　　3.当N/P为3.75时,质粒DNA完全被PEI-Chol及PEI包裹;当N/P比降为1.88时,泳道上可见游离DNA条带荧光,且PEI-Chol对质粒DNA的包裹能力高于PEI。PEI-Chol包裹质粒DNA可保护DNA免受核酸酶DNase I降解。
　　4.反相蒸发-机械振荡法制备的载siRNA真核表达载体的脂质微泡平均粒径为(3.8±0.9)μm,密度为1.3×108/ml,与赫赛汀抗体偶联后可特异性结合到SK-BR-3细胞。
　　结论:
　　本研究成功构建了沉默人survivin基因的siRNA真核表达载体,通过聚乙烯亚胺胆固醇衍生物结合到脂质微泡,并对载基因微泡进行靶向修饰,可特异性结合到表达HER-2的人乳腺癌细胞,为乳腺癌RNA干扰治疗提供一种新型的基因转移工具。

著录项

作者
魏巍丽;
展开▼
作者单位

福建医科大学;

展开▼
授予单位福建医科大学;
学科影像医学与核医学
授予学位硕士
导师姓名何以敉;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类乳腺肿瘤;免疫疗法;
关键词
乳腺肿瘤; 真核表达载体; 脂质微泡; 靶向修饰; RNA干扰技术; HER-2抗原; 肿瘤细胞;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. 携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建及其体外靶向性研究 [J] . 魏巍丽 ,林敏 ,陈志奎 . 中国超声医学杂志 . 2014,第005期
2. 携sialyl lewisx配基的靶向脂质微泡的构建及体外寻靶的试验研究 [J] . 刘世清 ,冉海涛 ,王志刚 . 中国超声医学杂志 . 2013,第006期
3. 靶向人类心脏发育候选基因hole的siRNA真核表达载体的构建和鉴定 [J] . 周军媚 ,姚峰 ,谢华平 . 中国动脉硬化杂志 . 2012,第5期
4. 靶向CrkL基因的siRNA真核表达载体的构建及对H9C2心肌细胞凋亡的作用 [J] . 朱炳豹 ,李刚 . 生命科学研究 . 2011,第002期
5. 靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定 [J] . 邹颖刚 ,薛惠荣 ,崔满华 . 中国实验诊断学 . 2010,第008期
6. 携RGDS脂膜氟烷微泡对血栓的靶向作用研究 [C] . 高云华 ,杨钰楠 ,夏红梅 . 重庆市第四届超声医学学术年会 . 2007
7. 构建携sialyl lewisx脂质微泡超声造影剂及其靶向显影实验研究 [A] . 刘世清 . 2013

携siRNA真核表达载体靶向脂质微泡的构建与表征

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅