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小菜蛾及甜菜夜蛾中肠液中Cry结合蛋白的分离与鉴定

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第1章 前言

1.1 Cry毒素

1.2 Cry毒素的杀虫机理模型

1.3 Cry毒素结合蛋白的鉴定

1.4 研究目的与意义

1.5 研究内容

第2章 材料与方法

2.1 甜菜夜蛾中肠液Cry毒素结合蛋白的分离与鉴定

2.2 小菜蛾中肠液Cry毒素结合蛋白的分离与鉴定

2.3 甜菜夜蛾中肠液Cry结合蛋白POXC的表达及纯化

2.4 小菜蛾中肠液Cry结合蛋白Dorsal的表达及纯化

2.5 Cry7Ab4毒素活性区的表达及纯化

第3章 结果与分析

3.1 甜菜夜蛾中肠液中Cry1Ab1结合蛋白的分离与鉴定

3.2 甜菜夜蛾中肠液中Cry1Ab1结合蛋白Sepoxc基因的克隆、表达与纯化

3.3 小菜蛾中肠液中Cry1Ab1结合蛋白的分离与鉴定

3.4 小菜蛾dorsal基因的克隆、表达及纯化

3.5 Cry7Ab4基因的表达

第4章 讨论

4.1 小菜蛾Dorsal与昆虫免疫反应

4.2 甜菜夜蛾POXC功能的推测

4.3 Cry7Ab4毒素及其结合蛋白的分离鉴定

4.4 结论与后续工作

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

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摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性菌,其在芽胞形成阶段产生的Cry毒素是一种对多种农林害虫具有特异杀虫活性的蛋白毒素。Cry毒素对非靶标生物无毒性,其制剂被广泛应用于农林害虫防治以及抗虫转基因作物改造。随着Cry制剂的大量使用,部分田间害虫已对Cry毒素产生抗性,抗性的产生严重妨害了Cry相关制剂的后续应用。因此,深入研究Cry杀虫作用时的分子过程,揭开Cry杀虫机理的全貌,是从根本上解决Bt发展问题的理论基础。目前公认的Cry作用机制模型主要有二种:穿孔模型和信号转导模型。Cry毒素与昆虫中肠刷状缘膜微囊(BBMVs)上受体的结合是Cry毒素发挥杀虫功能的关键步骤。至今有报道的BBMVs受体包括碱性磷酸酶(ALP)、氨肽酶N(APN)、钙黏蛋白(CAD)、ABCC2转运蛋白以及最新发现的V-ATPase亚基B。然而,昆虫中肠肠腔液中是否存在能够与Cry毒素结合的可溶性蛋白,以及其可能存在的对Cry杀虫过程的影响,还未有报道。因此本研究从昆虫中肠肠腔液中可溶性ry毒素非受体结合蛋白的新角度,研究Cry毒素杀虫的分子过程。
  本研究克隆表达了Cry毒素活性区,采用Pull-down essay、LC-MS/MS和分子对接等技术手段,从小菜蛾(Plutella xylostella)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠液中,发现了能够与Cry1Ab1结合的可溶性蛋白,包括小菜蛾的Dorsal和甜菜夜蛾的POXC。Dorsal是Toll信号通路中重要的转录因子并可以调控抗菌肽(AMPs)的表达水平。Cry毒素在被昆虫幼虫摄入后,可能干扰Toll信号通路并引起幼虫AMPs的过量表达从而导致昆虫幼虫的过免疫反应,在Cry穿孔机制的存在下,加速昆虫幼虫的死亡。POXC是典型的2-Cys过氧化物还原酶(Typical2-Cys peroxiredoxins)家族成员之一,PRX蛋白家族主要的功能是清除细胞内的活性氧簇(ROS)并参与细胞损伤的修复的过程,也有分泌型的PRX蛋白于细胞外发挥作用。Cry1Ab1和POXC的分子对接结果表明,Cry1Ab1和POXC结合会导致POXC的两个关键Cys残基被封闭,从而影响其过氧化还原酶活性。
  本研究构建SePOXC以及PxDorsal的原核表达系统成功完成了对SePOXC和PxDorsal的表达及纯化,为下一步体外结合实验及相关功能研究打下了基础。此外,本研究还构建了Cry7Ab4活性区的原核表达系统并完成表达,后续纯化及Cry非受体结合蛋白分离的工作还在及时地进行之中。
  综上所述,本研究首次证明昆虫中肠肠腔液中存在与BBMVs受体种类不同的可溶性Cry结合蛋白,且这些Cry结合蛋白可能干扰Cry毒素杀虫过程。我们基于本研究发现提出了全新的杀虫机制模型,该模型认为Cry1Ab1通过引起宿主机体过激的免疫反应加速Cry毒素的杀虫过程。

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