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抗肿瘤小分子化合物作用机制的初步研究及抗肿瘤药物对线粒体活性氧产生的影响

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摘要

第一章 绪论

1.1 细胞凋亡的线粒体通路研究

1.1.1 线粒体与细胞凋亡

1.1.2 Caspase依赖的细胞凋亡通路

1.1.3 线粒体凋亡通路的调控因素

1.1.4 ABT-737作用机制及特点

1.2 抗肿瘤药物对线粒体膜电位及ROS的影响

1.2.1 线粒体膜电位

1.2.2 线粒体与活性氧

1.2.3 单线粒体分析的重要性及主要方法

1.2.4 超高灵敏流式检测技术(HSFCM)

1.3 本论文的选题思路及主要研究内容

1.3.1 目标化合物抗肿瘤效果及其作用机制的初步研究

1.3.2 流式检测技术研究抗肿瘤药物对线粒体ROS的影响

参考文献

第二章 目标化合物抗肿瘤效果及作用机制的初步探讨

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 仪器与设备

2.2.2 实验材料与试剂

2.2.3 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 细胞的选择与培养

2.3.2 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡率

2.3.3 目标化合物对细胞ΔΨm的影响

2.3.4 目标化合物对细胞中线粒体O2?ˉ含量的影响

2.3.5 Western blotting定性考察Caspase-9及PARP的活化

2.3.6 Western blotting定性检测目标化合物直接刺激线粒体后Cyt c的释放

2.4 本章小结

参考文献

第三章 抗肿瘤药物诱导线粒体ROS的产生

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料与试剂

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验体系

3.3.2 细胞水平上线粒体O2?ˉ及总ROS含量变化的测定

3.3.3 单线粒体水平O2?ˉ含量的检测

3.4 本章小结

参考文献

第四章 总结与展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表论文及成果

致谢

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摘要

目的:(1)癌症已成为严重危害人类健康和生命的罪魁祸首之一。目前,化疗是治疗癌症的主要手段之一。因此,研发高效低毒的抗癌药物仍是攻克癌症的首要策略。本论文初步探究目标化合物(targetcompounds)的抗癌机制,为其的后续筛选、研发等提供理论和实验参考。(2)超氧阴离子(superoxideanion,O2(-))是活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的主要存在形式之一,在细胞分化、衰老、凋亡以及多种疾病中起重要作用。基于课题组自制的超高灵敏流式检测装置(highsensitivityflowcytometer,HSFCM)在灵敏度方面的独特优势,本研究尝试建立一种单线粒体水平线粒体O2(-)分析的新方法。
  方法:(1)通过流式细胞术(flowcytometry,FCM)和免疫印迹法(Westernblotting)初步研究目标化合物的抗癌效果及其作用机制。以HL-60细胞为模型,目标化合物刺激后,AlexaFluor(R)488AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡率;荧光探针MitoSOX和罗丹明123分别检测线粒体O2(-)含量和线粒体膜电位的变化。同时,Westernblotting检测细胞凋亡相关蛋白(Caspase-9和PARP)的活化;目标化合物直接刺激线粒体,Westernblotting检测细胞色素C(cytochromec,Cytc)的释放。(2)抗肿瘤药物刺激HeLa细胞,FCM检测细胞内线粒体O2(-)和总ROS含量的变化。不同呼吸底物存在时,抗肿瘤药物直接刺激提纯的线粒体,HSFCM检测O2(-)含量的变化。
  结果:(1)AnnexinV/PI双染法表明目标化合物均能诱导HL-60细胞凋亡,且具有浓度依赖性;后续结果表明这些化合物能引起线粒体膜电位降低、O2(-)含量增加、Cytc的释放、Caspase-9和PARP的激活,因此它们可通过线粒体通路诱导细胞凋亡。(2)细胞水平研究表明ABT-737几乎不能诱导O2(-)或总ROS的产生;叔丁基过氧化氢(tert-butylhydroperoxide,TBHP)能诱导总ROS显著升高但对线粒体O2(-)含量无影响;其它药物(抗霉素A、鱼藤酮、桦木酸、紫杉醇、星形胞菌素、维生素K)都能在不同程度上促进线粒体总ROS及O2(-)含量的升高。线粒体水平研究表明:抗霉素A、桦木酸、紫杉醇、星形孢菌素都能促进线粒体O2(-)含量升高;ABT-737、TBHP、维生素K对O2(-)含量均无影响;呼吸底物苹果酸盐和谷氨酸盐存在时,鱼藤酮诱导O2(-)含量升高,反之,O2(-)含量降低。
  结论:(1)本研究确定目标化合物通过线粒体通路诱导细胞凋亡,将为后续研发提供实验依据。(2)借助HSFCM及特异性的荧光探针,建立了单线粒体水平ROS分析的新方法,实现了抗肿瘤药物直接刺激提纯线粒体前后,O2(-)含量变化的单线粒体水平检测,有助于更明确地研究药物产生O2(-)的机理。

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