声明
缩略词表
第一章 猪病毒性腹泻六重RT-PCR检测方法的建立和应用
1.1 文献综述
1.1.1 猪流行性腹泻病毒分子生物学特性
1.1.2 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特性
1.1.3 猪轮状病毒病毒分子生物学特性
1.1.4 猪丁型冠状病毒分子生物学特性
1.1.5 猪札幌病毒分子生物学特性
1.1.6 病毒检测技术
1.2 研究的目的与意义
1.3 实验材料
1.3.1 病毒
1.3.2 实验病料
1.3.3 病料的处理
1.3.4 引物设计与合成
1.3.5 主要试剂
1.3.6 主要仪器设备
1.3.7 分子生物学分析软件和网站
1.4 试验方法
1.4.1 病毒RNA抽提
1.4.2 cDNA合成
1.4.3 单项RT-PCR
1.4.4 单项RT-PCR引物浓度
1.4.5 单项RT-PCR灵敏性实验
1.4.6 多重RT-PCR的引物浓度的确定
1.4.7 多重RT-PCR的特异性实验
1.4.8 多重RT-PCR的敏感性实验
1.4.9 多重RT-PCR的重复性实验
1.4.10 多重RT-PCR的最终体系的确定
1.4.11 多重RT-PCR 检测临床样品
1.5 结果
1.5.1 单项RT-PCR引物浓度的确定
1.5.2 单项RT-PCR敏感性实验
1.5.3 三重RT-PCR方法的扩增及优化
1.5.4 四重RT-PCR方法的扩增及优化
1.5.5 五重RT-PCR方法的扩增及优化
1.5.6 六重RT-PCR方法的扩增及优化
1.5.7 六重RT-PCR最终体系
1.5.8 多重RT-PCR敏感性
1.5.9 多重RT-PCR重复性
1.5.10 多重RT-PCR特异性
1.5.11 多重RT-PCR 检测临床样品
1.6 讨论
第二章 猪流行性腹泻病毒YT1401株分离、鉴定及分子进化特征分析
2.1 研究目的及意义
2.2 材料与方法
2.2.1 病料
2.2.2 工具酶和主要试剂
2.2.3 引物设计
2.2.4 病毒RNA抽提
2.2.5 PEDV鉴定及全基因克隆
2.2.6 PEDV YT1401株全基因组及S基因序列分析
2.2.7 参考序列的选取
2.3 结果
2.3.1 分离病毒的PCR鉴定结果
2.3.2PEDV YT1401全基因扩增基序列测定、拼接
2.3.3 PEDV YT1401株全基因组的遗传进化分析
2.3.4PEDV YT1401株S基因遗传进化分析
2.3.5PEDV YT1401株S蛋白分析
2.3.6 S蛋白的生物信息学分析
2.4 讨论
第三章 pET-30a与PEDV-N基因克隆构建、原核表达、纯化鉴定
3.1 研究的目的与意义
3.2 材料与方法
3.2.1 质粒与表达载体
3.2.2 实验菌株
3.2.3 主要酶与试剂
3.2.4 主要仪器设备
3.2.5 pET-30a载体制备
3.2.6PEDV N基因外源片段制备
3.2.7双酶切及纯化
3.2.8 重组质粒的构建
3.2.9 pET-N蛋白原核表达
3.2.10 SDS-PAGE分析
3.2.11 包涵体的纯化
3.2.12 Western Blotting分析
3.3实验结果
3.3.1 pET-30a质粒准确性验证
3.3.2 PEDV N基因全长的扩增
3.3.3 EcoRV和BamHI双酶切N质粒
3.3.4 阳性重组质粒pET-N的鉴定
3.3.5 阳性重组质粒pET-N挑单克隆菌液PCR鉴定
3.3.6 37℃、25℃、18℃ 诱导结果
3.3.7 咪唑梯度洗脱蛋白鉴定结果
3.3.8 Western Blotting分析
3.4.讨论
结论
参考文献
附录
在学期间的研究成果
致谢
兰州大学;
