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纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体对人肺癌裸鼠模型肿瘤生长的影响

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本课题研究包括两部分内容，第一部分为：TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体纳米脂质体的制备；第二部分为：纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体对人肺癌模型肿瘤体内生长的影响。分述如下： 目的： 第一部分：构建TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体，并用薄膜分散法制备miR-7真核表达载体纳米脂质体。 第二部分：常规建立人肺癌裸鼠模型，使用HE染色、实时荧光定量PCR、Western Blot、免疫荧光（Ki-67、TUNEL）等实验方法观察纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体对人肺癌裸鼠模型肿瘤生长的影响；同时初步评估其体内安全性。 方法： 第一部分：利用分子生物学技术构建TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体；使用薄膜分散法制备包裹miR-7真核表达载体的纳米脂质体；利用透射电镜、激光粒度及Zeta电位分析仪检测其外观、粒径、zeta电位、多分散指数PDI，利用透析法检测其包封率和稳定性。 第二部分：使用人肺癌95D细胞建立人肺癌裸鼠模型（每组各6 只）；模型建立成功后分别通过裸鼠尾静脉注射包裹100μg p-T-miR-7真核表达载体的纳米脂质体和包裹100μg p-T载体的纳米脂质体，随后每3天注射一次，并于每次注射前测量计算肿瘤体积，动态监测模型小鼠肿瘤体积变化，连续注射3次，且于末次注射3 天后将小鼠麻醉处死；分别取p-T-miR-7纳米脂质体组和p-T纳米脂质体组的肿瘤组织和肺脏组织，HE染色观察组织病理学改变；Real-time PCR和荧光共聚焦技术检测p-T-miR-7载体在肿瘤组织的表达情况，以及两组小鼠肿瘤组织中肿瘤生长相关因子CDK2、CDK3、CDK4 和CDK6和肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表达变化；随后观察两组肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67 的表达情况，以及TUNEL法观察两组肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡水平；Western blot 检测信号通路p-Akt，p-Erk 以及靶分子NDUFA-4的表达变化；分析荷瘤小鼠主要脏器的HE染色、脏器重量、脏器指数和血糖、血脂等生化指标变化，并用实时荧光定量PCR检测小鼠主要脏器的miR-7表达水平和p-T-miR-7载体质粒拷贝数分布情况以初步评估p-T-miR-7纳米脂质体体内治疗的安全性。 结果： 第一部分：首先分别成功构建TTF-1 启动子调控 miR-7 真核表达载体（pEGFP-N1-TTF-1-miR-7，命名为p-T-miR-7）和TTF-1启动子真核表达载体（pEGFP-N1-TTF-1，命名为p-T）。随后使用薄膜分散法分别制备包裹p-T-miR-7载体的p-T-miR-7纳米脂质体和包裹p-T载体的p-T纳米脂质体。利用透射电镜、激光粒度及Zeta电位分析仪分别检测其外观、粒径、zeta电位、多分散指数PDI，结果显示：两种纳米脂质体外观呈球形或近球形；p-T-miR-7纳米脂质体平均粒径为72.15 nm、zeta电位为-3.15mV、PDI指数为0.258，p-T纳米脂质体平均粒径为78.10 nm、zeta电位为-18.88mV、PDI指数为0.255；使用透析法检测其包封率，结果显示：p-T-miR-7纳米脂质体包封率为67%、p-T纳米脂质体包封率为64%，且包封率稳定。 第二部分：观察人肺癌裸鼠荷瘤模型肿瘤动态生长情况，统计分析肿瘤体积变化，结果显示：p-T-miR-7纳米脂质体实验组相比于p-T纳米脂质体对照组，肿瘤生长速度明显减缓(P＜0.05)；对人肺癌裸鼠荷瘤模型肺脏组织和肿瘤组织做石蜡切片HE染色观察可见：肺脏组织中相比于p-T对照组镜下观察到明显肺转移， p-T-miR-7实验组则无明显肺转移灶；肿瘤组织中相比于p-T对照组， p-T-miR-7实验组镜下可见大面积肿瘤坏死区域；Real-time PCR结果发现：相比于p-T对照组，p-T-miR-7实验组中miR-7的表达水平明显升高(P＜0.01)；荧光共聚焦显微镜观察发现p-T-miR-7组肿瘤组织中有大量EGFP蛋白表达；同时， p-T-miR-7实验组肿瘤组织中肿瘤生长相关因子CDK2、CDK3、CDK4和CDK6以及肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9、E-cadherin、CXCR4的表达均显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)；相比于p-T对照组，p-T-miR-7实验组肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67表达水平明显降低(P＜0.05)，TUNEL法则显示：相比于p-T对照组，p-T-miR-7实验组肿瘤组织中细胞凋亡明显增加；Western blot检测肿瘤组织中信号通路变化发现：相比于p-T对照组，p-T-miR-7实验组的p-Akt、p-Erk以及靶分子NDUFA-4蛋白表达水平明显下调，具有统计学差异(P＜0.05)；对纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体在体内的分布和安全性检测结果显示：p-T-miR-7实验组与p-T对照组相比，小鼠主要脏器：心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑组织、小肠、淋巴结的形态学与病理生理学均无明显差异，且脏器重量和脏器指数也无明显差异(P>0.05)；同时，两组小鼠相关生化指标TC、TG、GLU、AST和ALT均无明显差异(P>0.05)；最后，小鼠主要脏器中肺脏p-T-miR-7质粒拷贝数分布水平明显高于其他脏器，提示纳米脂质体可在肺脏中富集。 结论： 第一部分：利用薄膜分散法成功制备TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体的纳米脂质体； 第二部分：纳米脂质体递送TTF-1启动子调控miR-7真核表达载体可显著抑制人肺癌裸鼠模型肿瘤的生长。

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