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曲霉属(ASPERGILLUS)种间灭活原生质体融合及杂交育种的研究

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第一章绪论

1.1原生质体融合技术的发展

1.2植物细胞壁酶解液的选择

1.3原生质体融合的方法

1.3.1 PEG细胞融合法

1.3.2细胞电融合技术

1.3.3激光诱导的细胞融合技术

1.4原生质体融合子的再生

1.5原生质体融合子的鉴定方法

1.6原生质体灭活技术的回顾

1.7曲霉属原生质体技术的回顾

1.8本论文研究背景及研究内容

第二章原生质体制备与再生的研究

2.1实验材料

2.1.1供试菌株(亲本)

2.1.2培养基

2.1.3渗透压稳定剂

2.1.4酶液

2.2实验方法

2.2.1原生体的制备

2.2.2原生体的再生

2.3本章实验结果

第三章黑曲霉原生质体灭活和诱变的研究

3.1原生质体灭活机理分析

3.2实验材料

3.2.1供试菌株(亲本)

3.2.2灭活剂

3.2.3诱变剂

3.3实验方法

3.3.1黑曲霉原生质体灭活

3.3.2黑曲霉原生质体诱变

3.4本章实验结果与分析

3.4.1黑曲霉原生质体灭活

3.4.2黑曲霉原生质体诱变

第四章原生质体融合的研究

4.1原生质体融合的机制

4.2灭活原生质体融合的机制

4.3原生质体灭活程度对原生质体融合的影响

4.4影响原生质体融合的因素

4.5融合子的检测分析机理

4.6丝状工业真菌的遗传不稳定性

4.7原生质体融合技术在丝状工业真菌中的应用

4.8实验材料

4.8.1供试菌株(亲本)

4.8.2融合剂

4.9实验方法

4.9.1原生质体融合

4.9.2融合子的检测分析

4.9.3菌株产酶活力的测定

4.10本章实验结果与分析

4.10.1单亲灭活原生质体的融合

4.10.2双亲灭活原生质体的融合

4.10.3不同因素对原生质体融合率的影响

4.10.4原生质体融合的过程

4.10.5融合菌株产酶活力的测试

4.10.6融合子的检测分析

结论

参考文献

致谢

评定意见

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摘要

为提高黑曲霉产糖化酶的能力,改善其生产性能,尽快提高糖化酶工业企业的经济效益,本文对曲霉属(ASPERGILLUS)种间灭活原生质体融合及杂交育种技术进行了研究。首先对黑曲霉UV-11-46(Aspergillus niger UV-11-46)进行了原生质体灭活研究,获得了原生质体的对温度、紫外线、亚硝酸的临界致死剂量;其次以黑曲霉UV-11-46和臭曲霉2044(A.foetidus,2044,Lys-)为亲本,PEG为融合剂,成功地实现了种间灭活原生质体融合;最后对获得的融合再生菌株进行分析检测,初步确定4株为种间融合子,并进行摇瓶验证。结果如下: 1、黑曲霉原生质体的制备及再生:在每个铺有玻璃纸的GM平板上接种6~8滴浓度为10<'6>个/ml左右的纯净孢子悬浮液,31℃静止培养18小时,以0.8MNaCl作渗透压稳定剂,1.5%溶壁酶(Lywallzyme)31℃静置酶解3.5~4小时,原生质体产量可达10<'6>~10<'7>个/ml。以0.6M蔗糖作渗透压稳定剂,在拉氏高渗固体培养基上夹层再生,可获得20%以上的再生率。 2、臭曲霉原生质体的制备及再生:在每个铺有玻璃纸的GM平板上接种5~6滴浓度为10<'7>个/ml左右的纯净孢子悬浮液,31℃静止培养10小时,以0.8MNaCl作渗透压稳定剂,1.5%Lywallzyme、31℃静置酶解2.5~3小时,原生质体产量可达10<'6>~10<'7>个/ml。以0.6M蔗糖作渗透压稳定剂,在拉氏高渗固体培养基上夹层再生,可获得20%以上的再生率。 3、黑曲霉原生质体灭活条件:当原生质体浓度为10<'6>个/ml时,经50℃、5分钟热处理、20W紫外灯40cm距离照射150秒、0.025MHN02在pH4.6、31℃条件下处理9分钟,原生质体均可达到100%全灭活。 4、原生质体融合条件:经紫外线、热、亚硝酸灭活的黑曲霉原生质体与臭曲霉活原生质体混合,在35%PEG、pH7.5、0.01MCaCl<,2>、35℃条件下处理20分钟,融合率分别为2.70×10<'4>、1.30×10<'4>、2.25×10<'4>。 5、黑曲霉原生质体经紫外线、亚硝酸以及紫外线-氯化锂复合诱变,得到102号突变菌株,经摇瓶稀配方初筛、浓配方复筛,得到58、64、69、90号菌株,产糖化酶活力比对照株分别高24.16%、15.53%、16.81%、11.99%,将它们分别命名为P-58、P-64、P-69、P-90。 6、原生质体融合后获得的再生菌株,以融合子的检测分析,初步确定4株为融合株,经摇瓶浓配方复筛,其产糖化酶活力比对照株分别高19.75%、27.18%、30.64%、30.89%,将它们分别命名为NF-15、NF-19、NF-21、NF-46。

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