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携带aac(6')-Ib-cr及aac(6')-Ib-cr+blaCTX-M-27基因菌株的适应性研究

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1 前言

1. 1PMQR基因

1. 2PMQR的流行性

1. 3 超广谱β-内酰胺酶

1. 4PMQR与其他耐药机制的相互作用

2. 1材料

2. 2 方法

3 结果与分析

3.1 aac(6')-Ib-cr重组质粒的鉴定

3.2 构建双质粒菌株的aac(6')-Ib-cr和blaCTX-M-27基因检测结果

3. 3药敏试验结果

3. 4 质粒的稳定性试验

3. 5生长曲线

3. 6竞争实验

3. 7生物被膜形成能力分析

4 讨论

4.1 AAC(6’)-Ib-cr和CTX-M-27型ESBLs对抗生素的耐药性影响

4. 2 质粒对菌株适应性的影响

4. 3质粒对生物被膜的影响

5全文总结

致谢

参考文献

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摘要

质粒介导的喹诺酮耐药机制（PMQR）自发现以来，一直倍受国内外关注。尤其是同时介导氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物耐药的aac(6’)-Ib-cr基因，常常在产CTX-M型ESBLs的肠杆菌中检出，且这些菌多呈现高水平的氟喹诺酮和第三代头孢菌素类耐药。我们前期研究表明，aac(6’)-Ib-cr基因可能有利于捕获其它耐药质粒。本研究拟构建分别携带aac(6’)-Ib-cr、blaCT X-M-27及aac(6’)-Ib-cr+b laCT X-M-27基因质粒的大肠杆菌J53和沙门菌SH10菌株，研究携带单个或两个耐药基因质粒对菌株的耐药性，适应性及生物被膜形成能力的影响。研究结果为阐明aac(6’)-Ib-cr基因在细菌耐药性发展的作用及与CTX-M型ES BLs基因共存时能否增强菌株的适应性促进多重和高水平耐药的发展提供理论依据。
　　本研究首先利用电转化的方法，成功构建了分别携带aac(6’)-Ib-cr、b laCT X-M-27及aac(6’)-Ib-cr+b laCT X-M-27基因质粒的大肠杆菌J53和沙门菌SH10菌株，分别命名为J53+aac(6’)-Ib-cr、J53+bla CT X-M-27、J53+aac(6’)-Ib-cr+blaCT X-M-27、SH10+aac(6’)-Ib-cr、SH10+blaCTX-M-27及SH10+aac(6’)-Ib-cr+blaCTX-M-27。利用二倍琼脂稀释法分别测定了原菌及构建菌株的MICs。结果显示：与原菌J53和SH10相比，携带aac(6’)-Ib-cr质粒的菌株对环丙沙星、卡那霉素的MIC分别增加了2-4倍、32-128倍。携带blaCT X-M-27质粒的菌株增强了头孢菌素类药物的耐药性，尤其SH10对头孢噻肟和头孢噻呋显示高度耐药。与携带双质粒的SH10相比，携带aac(6’)-Ib-cr+blaCTX-M-27双质粒后大肠杆菌J53对头孢菌素类和喹诺酮类的MIC进一步提高。
　　本研究又通过测定质粒稳定性、生长曲线和竞争实验研究了携带aac(6')-Ib-cr、blaCT X-M-27及aac(6')-Ib-cr+b laCT X-M-27质粒菌株的适应性。质粒稳定性实验结果显示：菌株传代培养至第8天，携带blaCT X-M-27质粒菌株的稳定率仍为100%，携带aac(6')-Ib-cr菌株的稳定率降至80%，携带aac(6’)-Ib-cr+blaCTX-M-27菌株的稳定率降至85%。生长曲线结果显示：大肠杆菌J53+b laCT X-M-27、J53+aac(6’)-Ib-cr+b laCT X-M-27和J53生长能力相似，三者的生长能力都强于J53+aac(6’)-Ib-cr。沙门菌SH10、SH10+aac(6’)-Ib-cr和 SH10+blaCTX-M-27生长能力相似均强于SH10+aac(6’)-Ib-cr+blaCTX-M-27。竞争实验结果显示：携带双质粒aac(6’)-Ib-cr+blaCT X-M-27（J53+aac(6’)-Ib-cr+b laCT X-M-27和SH10+aac(6’)-Ib-cr+blaCTX-M-27）的菌株分别比仅携带aac(6’)-Ib-cr单质粒（J53+aac(6’)-Ib-cr和 SH10+aac(6’)-Ib-cr）的菌株有明显的竞争优势，但比仅携带blaCT X-M-27单质粒（J53+blaCTX-M-27和SH10+blaCT X-M-27）的菌株有明显的竞争劣势。且仅携带blaCT X-M-27单质粒（J53+blaCT X-M-27和SH10+blaCT X-M-27）的菌株均分别比原菌和仅携带aac(6’)-Ib-cr单质粒（J53+aac(6’)-Ib-cr和SH10+aac(6’)-Ib-cr）的菌株有明显的竞争优势。说明aac(6’)-Ib-cr单独存在不稳定，与blaCT X-M-27共存时可提高菌株的适应性更有利于其传播。blaCT X-M-27比aac(6’)-Ib-cr有优势，可单独存于菌株中广泛传播，不易丢失。
　　生物被膜形成能力结果显示：原菌J53、SH10没有或有很弱的生物被膜形成能力。当分别携带blaCT X-M-27，aac(6’)-Ib-cr的单质粒后，菌株都形成生物被膜，且携带aac(6’)-Ib-cr+b laCT X-M-27双基因质粒菌株的成膜能力比单质粒菌株更强。
　　结论：aac(6’)-Ib-cr质粒单独存在时容易丢失。当与blaCT X-M-27共存时，可增强菌株的竞争能力，提高菌株适应性，增强生物被膜形成能力，进而提高菌株的耐药水平。aac(6’)-Ib-cr与blaCT X-M-27共存时更有利于耐药基因的传播。

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