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长链非编码RNA在骨肉瘤中的差异性表达及SATB2-AS1对骨肉瘤的调控作用研究

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背景与目的：骨肉瘤是一种起源于骨间叶细胞的原发性恶性骨肿瘤，约3/4的患者发病年龄在10～30岁，是青少年最常见的骨骼恶性肿瘤，有起病急、肺转移早、死亡率高的特点。骨肉瘤临床治疗效果差，特别是转移或复发的病人，近50年来治疗并未取得的很大的进展，长期生存率不到25％。因此，寻求骨肉瘤治疗的新方法已成为临床迫切所需。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA分子。研究已发现，lncRNA对人类肿瘤的发生发展有着重要的调控作用。本论文着眼于lncRNA在骨肉瘤中的差异性表达及对骨肉瘤发生发展的调控作用，全文分两部分来展开论述。 方法与结果：第一部分主要论述lncRNA在骨肉瘤中的差异性表达及其意义。利用lncRNA芯片筛查7对骨肉瘤组织与瘤旁组织中的lncRNA表达谱，利用分层聚类、散点图和箱线图分析，可以直观的看出，与瘤旁组织相比，骨肉瘤组织中存在特征性表达的lncRNA。结合mRNA芯片信息和生物信息学相关技术，如GO分析、通路分析、编码和非编码RNA共表达网络等，发现lncRNA参与到细胞生物过程、细胞组分组成和分子功能等各个方面，细胞生命功能和结构的任何改变都会引起相应lncRNA的变化。结合lncRNA芯片和生物信息学技术，挑选了6条与骨肉瘤最有可能相关的lncRNA进行编码和非编码RNA共表达网络分析，发现246个mRNA与这6个lncRNA相关联，进一步对这些mRNA进行分析，发现三分之一的基因与蛋白结合和酶活性相关。这些分析结果表明lncRNA在骨肉瘤细胞的蛋白结合和酶活性方面扮演着重要角色。进一步挑选了12条lncRNA，采用qRT-PCR检测其在7对骨肉瘤及瘤旁组织中的表达，结果示qRT-PCR的检测结果与芯片结果方向基本一致，但两种方法检测的数值结果差异较大，整体上lncRNA芯片检测的结果比qRT-PCR的变化倍数要大（与瘤旁组织相比），说明lncRNA芯片比qRT-PCR敏感度高，应用lncRNA芯片结果时建议进一步行qRT-PCR验证。 本论文第二部分主要是结合lncRNA芯片结果、生物信息学技术和国内外研究进展，挑选出一条在骨肉瘤中特异性高表达的lncRNA作为研究对象，因其为基因SATB2的天然反义链，所以命名为lncRNA SATB2-AS1。首先在临床骨肉瘤标本中利用qRT-PCR检测SATB2-AS1的表达，结合临床病理结果和分期，结果示ATB2-AS1在骨肉瘤组织中高表达，与瘤旁组织比较，差异有统计学意义；与无伴转移的骨肉瘤组织比较，SATB2-AS1在有远处转移的骨肉瘤组织中表达更高，差异有统计学意义。因此，检测骨肉瘤组织中lncRNA SATB2-AS1的表达量并结合现有一些指标或者是联合检测若干个长链非编码RNA的表达情况可作为手术病人预后判断的参考指标，帮助临床医生进行治疗决策。 进一步在骨肉瘤细胞株中检测SATB2-AS1的表达。与正常人胚肺成纤维细胞HLF相比，SATB2-AS1在骨肉瘤细胞株中普遍呈高表达状态，在U2OS细胞中的表达最高。进一步构建siRNA干扰SATB2-AS1在骨肉瘤细胞中的表达，发现干扰后的U2OS和HOS细胞，SATB2-AS1表达量可以降到原来的10～30%左右；干扰后的骨肉瘤细胞生长速度减慢，细胞划痕修复实验中，细胞的迁移能力减弱，流式检测其细胞凋亡和周期发现细胞凋亡增加，细胞均呈现G0/G1期升高，S期明显减少，说明SATB2-AS1沉默后细胞呈现G0/G1阻滞，细胞复制受到抑制。同时，构建SATB2-AS1质粒，通过慢病毒转染构建SATB2-AS1更高表达细胞株，使SATB2-AS1在HOS和U2OS细胞中成上千倍高表达；与未干扰的骨肉瘤细胞比较，SATB2-AS1高表达的骨肉瘤细胞生长速度快，细胞划痕修复实验中细胞的迁移能力增强。以上结果说明lncRNA SATB2-AS1在骨肉瘤生长发育、转移过程中扮演着促癌基因的功能，抑制lncRNA SATB2-AS1的表达，可促进骨肉瘤细胞凋亡，使细胞周期阻滞，从而达到抑制肿瘤细胞生长、转移的目的。通过进一步的研究和开发，lncRNA SATB2-AS1有望成为骨肉瘤的治疗靶标。 最后，对lncRNA SATB2-AS1的作用机制进行了探索。因lncRNA SATB2-AS1为基因SATB2的天然反义链，推测SATB2-AS1通过调控基因SATB2的表达而实现对骨肉瘤细胞的调控。利用qRT-PCR检测HOS和U2OS SATB2-AS1高／低表达的细胞及其对应对照组细胞中SATB2-AS1和SATB2的表达，结果显示，无论是在HOS细胞还是U2OS细胞中，SATB2-AS1的降低或升高，SATB2mRNA的表达基本保持稳定。而在SATB2-AS1高表达的HOS和U2OS细胞中SATB2蛋白表达明显增高，而在SATB2-AS1低表达的细胞中，SATB2蛋白的表达明显减少。细胞质核分离后检测SATB2-AS1在细胞内的分布情况，结果示，SATB2-AS1在细胞质和细胞核中均有分布，主要分布于细胞质，约占总量的80%，与其干扰SATB2蛋白合成的功能相吻合。以上结果说明SATB2-AS1通过调控基因SATB2的翻译进而调控骨肉瘤细胞的生长与转移。 结论：本研究应用基因芯片及其他现代分子生物学分析技术对参与骨肉瘤生长发育的长链非编码RNA进行深入而广泛的探讨，为明确长链非编码RNA在骨肉瘤发生、发展过程中的重要作用奠定了理论和实验基础。本项目初步明确了lncRNA SATB2-AS1对骨肉瘤发生发展的调控作用，有望进一步开发为临床独特的骨肉瘤生物标志物，为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。

著录项

  • 作者

    刘四红;

  • 作者单位

    暨南大学;

  • 授予单位 暨南大学;
  • 学科 骨外科
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 郭奇峰;
  • 年度 2017
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类
  • 关键词

    长链; 非编码; RNA; 骨肉瘤; 差异性表达;

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