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不同光强和氮源条件下类波氏真眼点藻的生长、油脂积累和尿素代谢规律研究

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第一章 前言

1 微藻生产生物柴油前景概述

2 影响微藻生长及细胞内脂类积累的因素

3 微藻对氮元素的吸收利用

4 微藻脲酶及其编码基因

5 氮源、碳源与微藻细胞内储藏性脂类的关系

6 本论文的研究内容及意义

第二章 E. cf. polyphem对光照强度、氮源种类、氮源浓度的响应

1 材料与方法

2 实验结果与分析

3 讨论

第三章 E. cf. polyphem对尿素的吸收动力学研究

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

第四章 E. cf. polyphem脲酶活性研究

1 材料方法

2 实验结果及分析

3 讨论

第五章 E. cf. polyphem脲酶基因功能区的获取及表达研究

1 材料方法

2 结果分析

3 讨论

第六章 微藻培养光生物反应器的改进

1新型取样光生物反应器的设计理念

2 新型取样光生物反应器的可行性分析

第七章 总结与展望

参考文献

在校期间科研情况

致谢

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摘要

类波氏真眼点藻(Eustigmatos cf.polyphem)隶属于真眼点藻纲真眼点藻属,是一株土壤单细胞藻类,初期的研究表明其在培养后期细胞内富含储藏性油脂,在不同的培养时期还会积累二十碳五烯酸(EPA)及β-胡萝卜素,它是一株在生物柴油和生物活性物质开发方面具有潜在利用价值的藻株。因此,本文研究了光强、氮源种类及浓度对类波氏真眼点藻生长、细胞内总脂含量、总脂成分和脂肪酸组成的影响,另外还研究了类波氏真眼点藻对尿素的吸收、脲酶活性的变化规律及脲酶基因的表达情况。
　　本研究的主要结果如下:
　　(1)不同的光照强度、氮源种类以及氮源浓度都会对类波氏真眼点藻的生长产生影响,高光可以显著的促进类波氏真眼点藻的生物量增长,高光强下硝酸钠组的最高生物量为9 mmol/L浓度下的8.54 g/L,尿素组的最高生物量为4.5 mmol/L浓度下的9.71 g/L,低光强下硝酸钠组的最高生物量为9 mmol/L浓度下的6.45 g/L,尿素组的最高生物量为4.5 mmol/L浓度下的6.17 g/L。适宜该藻生长的组合条件为―高光—尿素氮源—4.5 mmol/L浓度‖,此时该藻有最大生物量为9.72 g/L。
　　(2)不同的光照强度、氮源种类以及氮源浓度都会对类波氏真眼点藻的细胞内总脂积累产生影响,高光低氮可以显著提高该藻的总脂含量,高光强下硝酸钠组的最高总脂含量为3.6 mmol/L浓度下的71.76％,尿素组的最高总脂含量为1.8 mmol/L浓度下的71.19%,低光强下硝酸钠组的最高总脂含量为3.6 mmol/L浓度下的65.20%,尿素组的最高总脂含量为1.8 mmol/L浓度下的63.35%。该藻在硝酸钠3.6 mmol/L、尿素1.8 mmol/L时有最高总脂含量,但此时生物量最低。适宜该藻总脂积累的组合条件为―高光—尿素氮源—3.0 mmol浓度‖,此时该藻有最大的总脂产率为0.327 g/L/d。
　　(3)类波氏真眼点藻细胞内主要积累的脂类为中性脂,随着培养时间的推移,细胞内糖脂和磷脂的含量都在不断下降而中性脂的含量一直在上升,不同的光照强度、氮源种类及浓度都会对类波氏真眼点藻细胞内的脂类组成产生影响,高光强下该藻细胞内中性脂的积累速度要快于低光强下的积累速度。氮源种类对该藻中性脂含量的影响并不明显,不同氮源种类下中性脂的差别只有0.27%~5.84%;该藻中性脂含量随着氮源浓度的降低而升高,糖脂及磷脂则相反。
　　(4)类波氏真眼点藻细胞内的主要脂肪酸为棕榈酸（C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:1)以及二十碳五烯酸(C20:5),高光强及低氮源浓度可以促进该藻合成C16:1,而低光照及高氮源浓度可以促进该藻合成EPA,EPA在培养的前期积累最多,同时,高光强下硝酸钠组的最高脂肪酸含量(绝对含量)为3.6 mmol/L浓度下的62.79%,尿素组的最高脂肪酸含量(绝对含量)为1.8 mmol/L浓度下的70.55%,低光强下硝酸钠组的最高脂肪酸含量(绝对含量)为3.6 mmol/L浓度下的60.30%,尿素组的最高脂肪酸含量(绝对含量)为1.8 mmol/L浓度下的54.68%。适宜该藻合成EPA的条件为―低光—尿素氮源—9 mmol/L浓度—第6天‖,这时该藻EPA的最大积累量(相对含量)为26.33%。
　　(5)类波氏真眼点藻对尿素的吸收速率和培养基中的尿素浓度的关系符合Michaelis–Menten方程(米氏方程),其最大吸收速率Vm=8.42 mg/h,半饱和参数Ks=1464.34,是一个具有很高的Ks的饱和动力学模型,同时,该藻在氮饥饿后对尿素的吸收并不敏感,而是在整个培养过程中都在缓慢吸收,区别于在短时间内将所有氮源全部吸收而后再缓慢利用的藻类。
　　(6)类波氏真眼点藻细胞内的脲酶活性在开始培养后的第48 h达到最高峰,此时的酶活力为0.116μmol·mg-1·h-1,而后逐渐下降,其变化幅度在培养的前72 h最为明显,后趋于稳定。
　　(7)类波氏真眼点藻细胞内脲酶由两条序列进行编码,151序列编码脲酶基因α大亚基,长度1018bp,55016序列编码脲酶基因β及γ小亚基,长度562bp;进化树分析显示类波氏真眼点藻α大亚基的编码序列与普林藻门和硅藻门的同源性高,而β及γ小亚基的编码序列则与烟曲霉菌的同源性高。该藻的脲酶基因是诱导表达的,脲酶基因的表达量在加入尿素进行培养后的第96 h达到最高峰,为对照的3.27倍。
　　(8)改进了实验室的一种微藻培养光生物反应器,优化后的反应器可以使实验的平均工作时间缩短至原来的50%左右。

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