血清淀粉样P物质对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响

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背景：
　　动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)疾病是指脂质在受累动脉管壁沉积，最先形成脂质条纹，发展为纤维斑块，最终形成粥样斑块的慢性过程，斑块破裂、血栓形成等可造成相应供血部位缺血坏死，造成心肌梗死、脑卒中等严重危害人类健康的疾病。随着居民生活水平的提高，动脉粥样硬化性心血管病(Atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)发病率和死亡率逐年攀升，已成为威胁中国乃至世界人群健康和疾病的重要杀手。作为ASCVD重要的病理生理基础，积极探索AS的发病机制和寻求安全有效的治疗方法成为国内外学者面临的重大课题。
　　血清淀粉样P物质(serum amyloid P component，SAP)是一种在进化上高度保守的环状五聚体结构蛋白，作为一种可溶性模式识别分子，是固有免疫的重要组成部分。由于SAP主要与淀粉样沉积物形成结合物存在，最初在淀粉样变性疾病中被人们发现，虽然与CRP同属于短正五聚蛋白超家族，但在炎症和固有免疫中的作用却不相同。近年来人们发现SAP除了参与阿尔茨海默病的发生，与心血管疾病如急性心肌梗死、不稳定性心绞痛等发病风险密切相关，此外还影响2型糖尿病的发生，而糖尿病人群是心血管疾病风险的高危因素。流行病学调查研究发现，SAP在冠心病病人血清中浓度明显高于普通人群;对临床病人的主动脉标本研究发现，动脉粥样硬化斑块内部有大量SAP沉积，并且与ApoCⅡ结合的方式共同出现，这证明SAP在心血管疾病尤其是AS中扮演重要角色，然而关于SAP对AS的具体作用及相关机制仍不是十分明确。
　　目的：
　　本研究通过对小鼠腹腔注射SAP，观察ApoE-/-小鼠AS斑块形成情况，比较SAP对ApoE-/-小鼠血脂水平，炎症因子(IL-6、IL-10和MCP-1)水平以及HDL功能（PON1活性、巨噬细胞胆固醇流出率）以及动脉粥样硬化的影响，从而探讨SAP影响AS进展可能的机制。
　　方法：
　　1、动物分组及干预
　　12只8周大小的C57BL/6雄性小鼠予普食喂养作为正常对照组;24只8周大小的雄性ApoE-/-小鼠予高脂饲料喂养。实验第12周时将24只高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠随机平均分成PBS组和SAP组，SAP组小鼠予腹腔注射SAP(6mg/g)，隔天一次，共2周;正常组和PBS组小鼠予腹腔注射同体积的PBS，隔天一次，共2周。正常组继续予普食喂养，PBS组和SAP组继续予高脂饲料喂养至第16周结束实验。
　　2、标本采集
　　实验结束时使小鼠禁食禁水共12小时，乙醚吸入麻醉，留取血液标本，离心后分装冻存备用。PBS冲洗血管后持续注入4％多聚甲醛灌注固定，大体显微镜下分离主动脉标本，一部分主动脉根部置于-20℃冻存，留做冰冻切片行油红O染色;其余主动脉置于4％多聚甲醛中固定24h，制作石蜡切片行HE染色和免疫组化染色。
　　3、血脂检测
　　取冻存备用的各组小鼠血清，采用小鼠血脂检测试剂盒在多功能酶标仪上检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。
　　4、血清PON1活性测定和巨噬细胞胆固醇流出率检测
　　以乙酸苯酯作为底物检测各组小鼠血清PON1活性;用[3H]胆固醇刺激RAW264.7细胞24小时，同时加入氧化低密度(ox-LDL)促进巨噬细胞吞噬，再加入各组小鼠血清促进[3H]胆固醇流出，分别收集细胞上清和细胞裂解物，采用液闪计数仪检测巨噬细胞[3H]胆固醇流出率。
　　5、炎症因子IL-6、IL-10、MCP-1和SAP表达水平检测
　　使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒检测三组小鼠血清IL-6、IL-10、MCP-1和SAP表达水平，实验方法参照相应试剂盒检测说明书。
　　6、主动脉斑块形成情况
　　HE染色观察主动脉横切面斑块形态并测量主动脉斑块面积大小;油红O染色观察大体主动脉斑块面积及斑块内脂质聚集情况。
　　7、斑块内CD68+巨噬细胞和SAP表达检测
　　免疫组化法检测主动脉斑块内CD68+巨噬细胞浸润和SAP表达情况。
　　8、统计学处理
　　所有的实验数据用均数±标准差（x±s）表示，利用专业统计软件SPSS20.0进行数据整理和统计分析。两组间数据比较采用t检验;三组间数据比较，如果方差齐性采用单向方差分析(one-way ANOVA)，如果方差不齐采用Welch校正检验。多重比较时，如果方差齐性使用LSD法检验，方差不齐使用Dunnett's T3检验，P＜0.05视为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1、各组小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平测定
　　与正常组小鼠相比，PBS和SAP组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均明显升高，有统计学差异(P＜0.05)，HDL-C水平明显降低(P＜0.05);与PBS组相比，SAP组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平虽无统计学差异(P＞0.05)，但有下降趋势，HDL-C水平有所上升，但尚未达到统计学差异。
　　2、各组小鼠血清PON1活性和巨噬细胞胆固醇流出率比较
　　与正常组(146.3±28.3ku/L)相比，PBS组(62.1±21.7ku/L，P=0.000)和SAP组(95.8±29.7ku/L，P=0.005)小鼠血清PON1活性明显下降，差异均具有统计学意义;SAP组PON1活性明显高于PBS组(P=0.046)，差异有统计学意义。
　　与正常组（13.7±2.5％）相比，PBS组(7.2±1.8％，P=0.000)和SAP组(9.4±1.7％，P=0.000)小鼠血清胆固醇转出率均明显降低，差异有统计学意义;SAP组与PBS组相比(P=0.017)，胆固醇转出率明显升高，差异具有统计学意义。
　　3、各组小鼠血清炎症因子IL-6、IL-10、MCP-1和SAP水平比较
　　与正常组(14.4±3.4pg/ml)相比，PBS组(21.3±1.8pg/ml，P=0.000)和SAP组(23.9±1.9pg/ml,P=0.000)小鼠血清IL-6水平均升高，差异均有统计学意义;SAP组与PBS组相比，明显升高(P=0.025)，差异具有统计学意义。
　　与正常组(199.3±58.2pg/ml)相比，PBS组(106.7±20.9pg/ml，P=0.000)小鼠血清IL-10水平明显下降，差异有统计学意义;SAP组小鼠血清IL-10水平(153.4±57.0pg/ml，P=0.106)较正常组降低，但差异无统计学意义;SAP组与PBS组相比，IL-10明显升高(P=0.012)，差异有统计学意义。
　　与正常组(125.0±45.5pg/ml)相比，PBS组(689.8±274.8pg/ml，P=0.000)和SAP(465.4±63.4pg/ml，P=0.003)组小鼠血清MCP-1水平明显升高，达到统计学差异;进一步比较SAP组和PBS组，前者MCP-1水平明显下降(P=0.032)，差异有统计学意义。
　　正常组(15.8±8.1ug/ml)小鼠血清SAP水平明显低于PBS组(83.2±39.5ug/ml)和SAP组(95.6±39.1ug/ml)，差异有统计学意义(P=0.001);SAP组与PBS组相比，前者SAP水平有所升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4、各组小鼠主动脉斑块形成情况
　　与PBS组(23.2±7.2％)相比，SAP组(14.5±5.3％)小鼠主动脉根部HE染色提示斑块面积明显降低(P=0.039)，差异具有统计学意义。
　　与PBS组(7.2±2.1×105um2)相比，SAP组(5.5±1.4×105um2)小鼠主动脉根部油红O阳性面积明显降低(P=0.028)，差异有统计学意义。
　　与PBS组（7.6±2.8％）相比，SAP组（4.1±1.6％）小鼠主动脉大体油红O染色阳性面积百分比明显下降(P=0.023)，差异有统计学意义。
　　5、小鼠主动脉斑块内CD68+巨噬细胞浸润情况和SAP表达测定
　　与PBS组（28.4±7.1％）相比，SAP组（18.0±3.7％）小鼠主动脉斑块内CD68阳性巨噬细胞含量明显降低，差异有统计学意义(P=0.01)。
　　与PBS组（1.62±0.14％）相比，SAP组（2.14±0.45％）小鼠主动脉斑块内SAP阳性面积明显增多，差异有统计学意义(P=0.034)。
　　结论：
　　1、SAP可改善HDL功能，包括提高PON1活性水平，增加巨噬细胞胆固醇转出率。
　　2、SAP改善HDL功能的同时可以调节炎症反应，包括升高抗炎因子IL-10的浓度，抑制促炎因子MCP-1的水平，但同时也上调IL-6水平。
　　3、SAP可减轻斑块内CD68+巨噬细胞浸润程度，减少巨噬细胞来源的泡沫细胞。
　　4、SAP可以减少ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化面积。
　　5、通过本研究，发现:SAP可能通过改善HDL功能、减轻炎症反应，减少巨噬细胞来源的泡沫细胞，从而减轻动脉粥样硬化的发展。

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作者
赵金珍;
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作者单位

南方医科大学;

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授予单位南方医科大学;
学科心血管内科学
授予学位硕士
导师姓名郭志刚;
年度 2017
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正文语种中文
中图分类 R543.502;
关键词
动脉粥样硬化; 发病机制; 血清淀粉样P物质; 巨噬细胞; 炎症反应;

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