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短链胸腺基质淋巴生成素对甲苯二异氰酸酯诱导的哮喘气道炎症的影响及其作用机制

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摘要

前言

第一章 short TSLP对TDI哮喘气道炎症的影响及可能机制

1．1 前言

1．2 材料与试剂

1．3 方法

1．4 结果

1．5 讨论

第二章 short TSLP对TDI-HSA所诱导的气道上皮HMGB1、RAGE和long TSLP表达的影响

2．1 前言

2．2 材料与试剂

2．3 方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

全文小结

参考文献

攻读硕士期间主要成果

缩略词表

致谢

声明

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摘要

目的:
　　二异氰酸酯类是一类重要的致敏原，被广泛应用于刚性或软质聚氨酯泡沫工业生产中，作为一种良好的硬化剂也被应用于聚氨酯喷涂涂料和粘合剂生产中，是许多工业化国家中导致职业性哮喘最常见的原因。甲苯二异氰酸酯(TDI)是其主要类型之一，TDI所导致的职业性哮喘可产生典型的哮喘病理特征，主要包括:气道高反应性和气道炎症，气道炎症主要与淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润相关。然而针对其所导致的哮喘炎症机制研究仍然十分匮乏。
　　胸腺基质淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一种类白介素(IL-7)细胞因子。TSLP主要表达于上皮细胞和皮肤角质细胞。近来研究表明，其他细胞类型如肥大细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、树突状细胞、滋养层细胞以及肿瘤或肿瘤相关细胞均可以表达TSLP。在受到各种内源性或外源性物质刺激时，TSLP表达增多，并与机体紊乱或维持稳态相关。如气道受到外界过敏原如屋尘螨或病原体刺激时会分泌大量的TSLP，进而作用于树突状细胞，上调OX40配体，促进炎症因子IL-4，IL-5，IL-13和TNF-γ表达及释放，而反过来，高水平IgE和Th2相关的细胞因子(IL-4，IL-13，IL-25和IL-33)又可以促进TSLP的表达，从而形成正反馈，不断放大气道Th2炎症，促进疾病的发生发展。研究表明在卵清蛋白(OVA)哮喘小鼠模型中敲除TSLP受体后，气道炎症明显改善。而予以肺部过表达TSLP后，再予过敏原刺激，小鼠可出现明显的气道嗜酸性粒细胞炎症、粘液高分泌及气道重塑。在临床哮喘患者中，TSLP表达明显升高，并与气道炎症及气道阻塞呈正相关，而予以TSLP单克隆抗体治疗后可明显改善哮喘患者临床症状。因此，TSLP与哮喘的发病更是息息相关。
　　然而，最新研究表明，人TSLP具有两种亚型，即长链TSLP(long TSLP,lTSLP)和短链TSLP(short TSLP，shTSLP)，他们结构相似，作用却完全不同。Long TSLP即全长TSLP(full-length TSLP)，其分子量大小为25KDa，既往绝大多数关TSLP的研究主要指long TSLP，最早发现TSLP亚型区别的是日本的一位学者Harada M，他首次报道了当人气道上皮细胞系受到poly(I∶C)刺激时会促进long TSLP表达，而不是shortTSLP，因此提示了long TSLP才是导致Th2炎症的关键因子，与shortTSLP的作用可能具有差异性。而最近有关TSLP亚型的研究进一步明确了他们的差异性，在小鼠肠炎模型中，shortTSLP治疗后可明显改善小鼠体重减轻并更快恢复，表明short TSLP可以保护肠炎。而且，short TSLP在体外亦可以抑制细菌的生长，发挥抗菌活性。而本课题组最新研究亦表明在屋尘螨哮喘动物模型中short TSLP亦发挥了一定的抗炎及气道屏障保护作用。那么，基于TSLP亚型的作用差异性，尤其是short TSLP的抗炎作用，大大提高了我们对TSLP的认识，目前有关short TSLP在哮喘中的作用仍少见报道，我们有必要进一步探讨short TSLP对哮喘气道炎症的影响及其可能的作用机制。本研究第一个目的，应用TDI哮喘小鼠模型，予以short TSLP多肽处理后，观察其对气道炎症的影响。
　　气道上皮细胞作为气道与外界环境的第一道防线，不仅发挥着物理屏障的作用，更是一道免疫屏障，当气道上皮受到外界各种过敏原和病原体刺激时，会分泌大量的炎症介质，如IL-25、IL-33、TSLP、HMGB1等，进而发挥免疫调节及启动哮喘气道炎症的作用。本课题组前期研究中已经证明，高迁移率族蛋白1(HMGB1)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)轴在TDI哮喘气道炎症中发挥了重要作用，并可以激活PI3K/Akt信号通路，因此本研究的第二个目的，在体外合成TDI-HSA复合物并刺激人气道上皮细胞系16HBE细胞，观察其对HMGB1-RAGE轴信号及TSLP亚型表达的影响，以及short TSLP在其中的作用。
　　方法:
　　1. 动物实验
　　1.1 建立TDI哮喘小鼠模型，分别通过气管内给药和腹腔注射给药方式在每次激发前30min予以short TSLP处理小鼠
　　1.2 检测小鼠气道高反应性
　　1.3 动物标本检测:取血并检测血清总IgE水平，小鼠淋巴细胞培养并检测淋巴上清中Th1相关炎症介质IFN-γ及Th2相关炎症介质IL-4，IL-5，IL-13分泌水平，支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数，小鼠肺组织病理染色，肺组织HMGB1，RAGE，TSLP及信号分子p-STAT3、p-STAT5的免疫组化及蛋白免疫印记。
　　2. 细胞实验
　　2.1 体外培养正常人气道上皮细胞系16HBE细胞，分别用TDI-HSA和rhHMGB1处理细胞，并予以shortTSLP进行预处理。
　　2.2 蛋白印记及实时定量PCR检测16HBE细胞HMGB1，RAGE，lTSLP及多种信号通路蛋白及lTSLP和shTSLP mRNA的表达
　　2.3 细胞免疫荧光双染技术检测HMGB1-RAGE在细胞中的表达分布情况
　　3. 统计学处理
　　采用SPSS20.0软件进行统计分析，资料以均数±标准差表示，多组间总体均数比较采用单因素方差分析，方差齐时采用Bonferonni方法，方差不齐时用Dunnett's T3方法，以p＜0.05为有统计学意义。
　　结果:
　　1. 动物实验
　　1.1 TDI组小鼠气道反应性明显增高，而short TSLP治疗后明显改善气道高反应性，并且抑制TDI小鼠血清总IgE水平，减少TDI哮喘小鼠淋巴细胞培养上清中Th1相关炎症介质IFN-γ及Th2相关炎症介质IL-4，IL-5，IL-13释放，BALF细胞分类计数结果示:TDI组嗜酸性粒细胞和中性粒细胞明显增多，而予short TSLP治疗后明显减少。肺组织病理结果示:TDI组小鼠气道周围炎症细胞浸润明显，气道上皮增厚，呈增生改变，而short TSLP治疗组其炎症细胞浸润明显减少，气道增生不明显。
　　1.2 TDI小鼠肺组织HMGB1、RAGE、TSLP及p-STAT5表达明显增多，而予以shortTSLP治疗后明显减少。
　　2. 细胞实验
　　2.1 TDI-HSA和rhHMGB1均可促进RAGE和long TSLP表达及信号分子STAT5(Y694)、Akt(S473)和p38MAPK(T180/Y182)的磷酸化。
　　2.2 short TSLP可抑制RAGE和long TSLP蛋白表达及Akt(S473)、p38MAPK(T180/Y182)和STAT5(Y694)磷酸化。
　　2.3 short TSLP抑制TDI所诱导的HMGB1核浆转位及HMGB1-RAGE共定位。
　　结论:
　　shortTSLP可明显改善TDI哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症，其机制可能与其抑制HMGB1、RAGE和lTSLP的表达及STAT5(Y694)的磷酸化有关。

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