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Zeste基因增强子同源物1,2介导miR-214抑制心肌纤维化的作用研究

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摘要

前言

第一章 miR-214在小鼠纤维化心肌中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

第二章 过表达miR-214对小鼠心肌纤维化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

第三章 miR-214对纤维化相关基因表达的影响及其靶基因鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

讨论

全文总结

参考文献

附录

攻读硕士学位期间成果

致谢

声明

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摘要

本文将利用Ang-Ⅱ灌注小鼠诱导心肌纤维化动物模型、Ang-Ⅱ处理心肌成纤维细胞诱导心肌纤维化细胞模型，通过双荧光报告基因实验，mimics介导过表达miR-214-3p，siRNAs介导分别沉默EZH1和EZH2表达等方法，在整体和细胞水平上明确miR-214在心肌纤维化中的作用;研究miR-214-3p是否能在转录水平调控EZH1和EZH2表达;验证上述靶基因是否介导了miR-214-3p对心肌纤维化的调控作用。本文将阐明心肌重构中miR-214-3p调控心肌纤维化的分子机制，为基于miRNAs的心肌纤维化治疗研究提供科学依据。
　　第一章 miR-214在小鼠纤维化心肌中的表达
　　目的:建立小鼠心肌纤维化的动物模型，明确miR-214在发生重构小鼠心肌组织中的表达情况。
　　方法:1.选取SPF级体重约20～25 g的雄性C57/BL6小鼠为实验对象，通过植入Ang-Ⅱ胶囊渗透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纤维化的动物模型。模型组和假手术组各8只;2.采用尾压法检测小鼠收缩压，并测量心脏重量与胫骨长度，计算相应比值;3.动物B超检测小鼠心肌结构与心功能相关指标;4.采用Masson三色染色对小鼠心肌组织进行胶原纤维的染色观察;5.RT-qPCR和Western-Blot分别检测小鼠心肌组织中纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的mRNA和蛋白表达水平;6.用miRNAs表达谱芯片检测Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌中miRNAs的表达谱，RT-qPCR验证小鼠心肌中差异表达的miRNAs。
　　结果:1.与生理盐水(Saline)组相比，Ang-Ⅱ灌注组小鼠收缩压明显升高，心脏重量与胫骨长度比值(HW/TL)明显高于对照组。2.动物心脏B超结果显示，与saline组比较，Ang-Ⅱ灌注组小鼠室间隔和心室壁厚度增加，左室容积变小，而反映心功能的射血分数(EF)和左室短轴缩率(FS)均显著增加。3.Masson三色染色的结果显示，比较saline组，模型组小鼠心肌组织胶原含量增加，纤维化程度加剧。4.RT-qPCR和Western-Blot的结果显示，模型组小鼠心肌中纤维化相关基因Col1a1，Col3a1，α-SMA的mRNA和蛋白水平显著上调。5.miRNAs表达谱芯片结果显示，与Saline组相比，模型组小鼠心肌中miRNAs表达异常，经RT-qPCR验证，其中明显下调的miRNAs有miR-1，-133b，-16，-214，而miR-21表达显著上调，以miR-214在Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌组织中下调最为显著。
　　结论:1.与saline组相比，模型组小鼠心肌组织发生病理性心肌纤维化，说明我们通过Ang-Ⅱ灌注成功建立心肌纤维化动物模型。2.miR-214在Ang-Ⅱ灌注诱导的重构小鼠心肌中表达显著下调。
　　第二章 miR-214对小鼠心肌纤维化的影响
　　目的:明确过表达miR-214对小鼠心肌纤维化的影响。
　　方法:1.选取SPF级体重约20～25 g的雄性C57/BL6小鼠为实验对象，通过植入Ang-Ⅱ胶囊渗透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纤维化的动物模型。模型组和Saline组分别尾静脉注射20 nmol agomiR-214和agomiR-NC，每组各8只动物;2.测量心脏重量与胫骨长度，计算相应比值;3.动物心脏B超检测小鼠心肌结构与心功能相关指标;4.采用Masson三色染色对小鼠心肌组织进行胶原纤维的染色观察。5.Western-Blot检测小鼠心肌组织中纤维化相关蛋白(Col1a1，Col3a1，α-SMA)表达水平。
　　结果:1.与Saline组相比，模型组小鼠心脏重量与胫骨长度比值(HW/TL)明显增加。而与agomiR-NC组相比，agomiR-214组HW/TL值显著降低。2.动物B超结果显示，比较saline组，模型组小鼠室间隔和心室壁厚度增加，左室容积变小，而反映心功能的射血分数(EF)和左室短轴缩率(FS)均显著增加。而与agomiR-NC组相比，尾静脉注射agomiR-214显著改善Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌重构和心功能代偿性增强效应。3.Masson三色染色的结果显示，比较saline组，模型组小鼠心肌组织胶原含量增加，纤维化程度加剧。与agomiR-NC组相比，agomiR-214组纤维化程度降低。4.Western-Blot结果显示，比较saline组，模型组小鼠心肌组织中纤维化相关蛋白水平显著增加。与agomiR-NC组相比，agomiR-214组纤维化相关蛋白表达降低。
　　结论:过表达miR-214可减缓Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌组织胶原沉积和心肌重构，并恢复心脏功能。
　　第三章 miR-214对纤维化相关基因的调控作用及其靶基因鉴定
　　目的:明确miR-214对心肌成纤维细胞中纤维化表型的影响;对miR-214进行靶基因鉴定，并明确上述靶基因是否介导了miR-214对心肌纤维化的调控作用。
　　方法:1.原代分离培养4 w C57/BL6小鼠心肌成纤维细胞，并通过细胞免疫荧光法检测P3代心肌成纤维细胞(CFs)中α-SMA的表达;2.免疫荧光法检测心肌成纤维细胞中纤维化相关蛋白(Col1a1，Col3a1，α-SMA)表达水平;3.利用pGL3-promoter荧光素酶载体构建含miR-214结合位点的EZH1，EZH2基因3'UTR重组质粒以及相应的3'UTR结合位点突变的重组质粒，分别与miR-214mimic共转染HEK293T细胞，双荧光素酶报告基因实验鉴定EZH1和EZH2是否为miR-214的作用靶点;4.通过转染miR-214 mimic在CFs中过表达miR-214，RT-q PCR和Western Blot检测EZH1和EZH2的mRNA和蛋白表达水平;5.10-5M Ang-Ⅱ处理CFs24h，Western Blot检测EZH1、EZH2、纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)水平变化;6.分别将EZH1 siRNA、EZH2siRNA和miR-214 mimic转染CFs，RT-q PCR和Western Blot检测EZH1、EZH2、纤维化相关基因（Col1a1，Col3a1，α-SMA）以及PPARγ的mRNA和蛋白表达水平;7.腺病毒介导在CFs中分别过表达EZH1和EZH2，Western Blot检测EZH1、EZH2、纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)以及PPARγ的表达水平变化;8.PPARγ siRNA转染CFs，Western Blot检测纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)以及PPARγ的表达水平变化。
　　结果:1.P3代心肌成纤维细胞中有特异的α-SMA表达，所培养心肌成纤维细胞的纯度达95％以上。2.转染miR-214 mimic后，心肌成纤维细胞中纤维化相关蛋白(Col1a1，Col3a1)的表达显著降低。3.双荧光素酶报告基因实验显示在miR-214 mimic作用下，与对照组相比，miR-214与EZH1、EZH23'-UTR的结合能力显著增加，荧光素酶活性均显著下降。而转染诱导突变的重组质粒则不能改变荧光素酶活性。4.心肌成纤维细胞中过表达miR-214后，EZH1和EZH2的mRNA和蛋白水平均一致性的显著下调。5.EZH1和EZH2在Ang-Ⅱ诱导的心肌纤维化细胞模型中表达显著上调。6.利用siRNAs沉默心肌成纤维细胞中EZH1和EZH2表达后，纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的mRNA和蛋白表达水平均被抑制，而PPARγ的表达显著增加，这与在心肌成纤维细胞中过表达miR-214的作用相一致。7.在心肌成纤维细胞中过表达EZH1和EZH2后，纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的蛋白水平显著增加，而PPARγ的表达显著降低。8.沉默PPARγ表达后，心肌成纤维细胞中纤维化相关基因(Col1a1，Col3a1，α-SMA)的蛋白水平显著增加。
　　结论:1.EZH1和EZH2是miR-214的作用靶基因。2.miR-214通过在转录水平抑制EZH1和EZH2，使PPARγ表达增加，进而降低心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达。
　　全文总结:miR-214在Ang-Ⅱ灌注诱导的小鼠心肌纤维化动物模型中表达下调。尾静脉注射miR-214可减缓Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌组织胶原沉积和心肌重构，并恢复心脏功能。miR-214的抗心肌纤维化作用主要是通过在转录水平抑制小鼠心肌成纤维细胞中EZH1和EZH2表达，进而上调PPARγ表达，降低纤维化相关基因的表达。

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