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氯胺酮对SD大鼠外毛细胞细胞水平电生理反应特性的影响

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摘要

第一章 引言

第二章 材料与方法

1 实验材料与仪器

1．1 实验动物

1．2 实验仪器

1．3 溶液配制

2 实验方法

2．1 耳蜗外毛细胞的分离

2．2 玻璃微管电极制备

2．3 全细胞记录模式形成

2．4 注意事项

2．5 膜片钳电刺激方案

2．6 分组

2．7 给药方法

2．8 数据的采集和分析

第三章 实验结果

1 SD大鼠耳蜗外毛细胞正常形态学及活性的观察

2 观察给药方法对外毛细胞全细胞电流的影响

3 绘制氯胺酮浓度曲线，确定实验浓度

4 观察100μM／L氯胺酮对外毛细胞全细胞电流的影响

5 观察100μM／L氯胺酮对外毛细胞上乙酰胆碱电流的影响

6 观察用士的宁阻断乙酰胆碱受体后外毛细胞氯胺酮敏感性全细胞电流的变化

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 听觉感受器细胞---外毛细胞的功能发育

成果

致谢

声明

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摘要

全身麻醉药在临床手术中被广泛应用，在围术期显著影响患者的多种生理功能，尤其是感觉功能。听觉作为人体感受外界信息的重要方式，在全身麻醉过程中，往往是最后消失，而在麻醉苏醒中是最先恢复的，因此听觉功能在临床实践中常常被用作判断麻醉状态的重要指标之一。研究麻醉剂对听觉功能的影响具有重要的临床意义，也越来越被予以重视。在临床麻醉中，一些病人出现了听力损伤，而这种听力受损有些是有临床症状可以被发现重视的，而绝大多数是亚临床的，只能通过听力专科检查才能被发现，常常被麻醉医生忽视。麻醉过程中多种因素可以影响听觉，如麻醉方式、体外循环、耳毒性药物、血流动力学变化、中耳压力改变等。目前已经有报道，氧化亚氮可引起听力损害，氯胺酮可引起患者幻听、耳鸣。全麻药对听觉系统的作用可以分别影响听觉神经中枢和听觉外周的功能。目前大量的动物实验和临床研究都集中于中枢水平，关于全麻药对听觉外周系统作用的研究均为间接检测耳蜗耳声发射来推断对听觉外周感受器毛细胞功能的作用，尚无使用分离毛细胞通过膜片钳方法研究全麻药对毛细胞功能的研究。已有研究通过该方法确定了水杨酸类、氨基糖苷类抗生素、速尿等药物对外毛细胞的损害作用，发现了其耳毒性机制。故本研究拟采用膜片钳技术，检测氯胺酮对外周听觉感受器中有耳蜗放大器功能的外毛细胞细胞水平电生理特性的影响并探讨其作用机制。
　　目的:研究氯胺酮对Sprague Dawley(SD)大鼠耳蜗外毛细胞细胞水平电生理反应特性的影响，探讨氯胺酮对外毛细胞电生理反应的作用机制，结合既往研究结果综合评价氯胺酮对外毛细胞的影响，从而对了解全身麻醉药相关听觉损伤，为临床防治围术期暂时性或永久性听觉损伤提供理论依据和新的思路。
　　方法:本研究采用对单个离体外毛细胞自身前后对照方法，以避免个体差异对实验结果的影响。选用21～28天龄健康成年SD大鼠40只，40～70 g，雌雄不拘，迅速断头处死，暴露两侧耳蜗，直视下迅速解剖出双侧听泡置于含正常细胞外液L-15约2 ml的培养皿中，置于解剖显微镜低倍镜下将听泡表面的结缔组织剥离干净，分离出双侧完整的耳蜗，在高倍镜下采用机械-酶分离法获得离体单个外毛细胞。用细螺旋钢针向上挑开顶端蜗壳，逐层剔除蜗壳，绕着蜗轴改用尖端小于1 mm的镊子小心夹取顶回及中回基底膜，将基底膜置于含L-15的培养皿中，剪碎后加入胶原酶V消化5 min，加入新鲜L-15终止消化，用200μL移液器轻轻吹打使细胞分散，转置于含有约1 ml L-15细胞外液直径1cm的凹槽板内，静置10 min贴壁后，置于防震台显微镜下观察，辨认变形及死亡的外毛细胞。选择活性好的单离外毛细胞进行观察和实验。实验过程中持续使用蠕动泵，更换凹槽板中的液体，保证凹槽板中的细胞外液始终符合实验条件。使用膜片钳全细胞记录模式记录。
　　实验包括5个部分:随机选取活性较好外毛细胞进行自身配对实验。
　　(1)观察给药方法对外毛细胞全细胞电流的影响:在电压钳下，给予连续变化的阶跃式脉冲电压刺激，比较在5个外毛细胞在L-15细胞外液中，分别在无给药（C组）、1 min后给L-15（L组）约15s后各电压下全细胞电流，绘制稳态电流-电压(I-V)曲线。
　　(2)绘制药物浓度曲线，确定氯胺酮实验浓度:在电压钳下，Vh=3 mV,记录5个外毛细胞分别前后给药氯胺酮(1μM/L，10μM/L，100μM/L，1000μM/L,5000μM/L)，比较各组氯胺酮敏感性电流幅度，绘制药物浓度曲线。
　　(3)观察100μM/L氯胺酮对外毛细胞I-V曲线及静息膜电位的影响:给予连续变化的阶跃式脉冲电压刺激，比较在L-15细胞外液中，10个外毛细胞在无给药组（N组）15s、1 min后给药100μM/L氯胺酮（K组）15s、1 min后重复N组（N'组）15s后外毛细胞各电压下全细胞电流，绘制三组稳态I-V曲线;观察现象后，换成电流钳Ih=0 pA，比较N、K两组细胞静息膜电位。
　　(4)观察100μM/L氯胺酮对外毛细胞上乙酰胆碱电流的影响:给药100μM/L乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)，比较10个外毛细胞在Vh=3 mV下将细胞外液L-15灌流为100μM/L氯胺酮前1min（K1组）、灌流后（K2组）及洗脱后1min(K3组)乙酰胆碱电流IACh。
　　(5)观察用士的宁阻断乙酰胆碱受体后外毛细胞氯胺酮敏感性全细胞电流的变化:给药100μM/L氯胺酮，比较10个外毛细胞分别在Vh=3 mV下L-15细胞外液灌流为0.1μM/L士的宁前1min（S1组）、灌流后（S2组）及洗脱后1min（S3组）的氯胺酮敏感性电流。
　　实验中通道电信号经膜片钳放大器后再经A/D、D/A转换器输入计算机，由pCLAMP10.3软件程序发放刺激和采集信号。应用SPSS20.0统计软件进行Student t检验分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。使用Origin8.0软件绘制图形。
　　结果:随机选取贴壁良好，细胞膜光滑完整，胞浆呈半透明状，细胞核呈圆形位于胞体底部，细胞器主要分布于表皮板下和核周，细胞内无布朗运动性颗粒，细胞周围有明显光晕，或称之为双折射现象，纤毛完整无弯折的外毛细胞进行实验。
　　(1)典型外毛细胞在L-15中的I-V曲线表现为在细胞超极化方向（反转电位以左）总电流为内向，在细胞去极化方向（反转电位以右）总电流为外向，内向电流的幅度较小，外向电流在刺激电压去极化至约-50 mV以上时越来越大，并呈明显的电压依赖性和外向整流性。对比5个外毛细胞在C组和L组中的I-V曲线，发现两组各刺激电压下的膜总电流均无统计学差异，说明给药方式（药流扩散）不会对后续实验的观察产生干扰。
　　(2)一个典型外毛细胞对不同浓度氯胺酮的反应为，给药1μM/L氯胺酮，细胞总电流幅度变化为0 pA，10μM/L氯胺酮可使总电流幅度下降17 pA，100μM/L氯胺酮可使总电流幅度下降约80 pA;同样方法观察浓度1000μM/L及5000μM/L氯胺酮，分别可使外毛细胞总电流幅度下降153 pA、184 pA。可发现随着氯胺酮浓度增大，外毛细胞外向总电流下降幅度随之增大。共记录5个外毛细胞，现象一致。取5个外毛细胞氯胺酮敏感性电流幅度平均值用Hill方程拟合氯胺酮浓度曲线，半数有效浓度IC50=117.3μM/L，100μM/L氯胺酮处于曲线最大斜率处，1000μM/L及5000μM/L浓度下细胞反应逐渐移形为平台期，以5000μM/L氯胺酮的敏感性电流幅度为100％，100μM/L氯胺酮敏感性电流幅度接近50％，说明在该浓度下细胞反应最为灵敏，故下面实验取氯胺酮100μM/L浓度为实验浓度。
　　(3)绘制10个外毛细胞在N、K、N'三组的I-V曲线，发现与N组相比，N'组各指标均无统计学差异，K组在去极化超过-36 mV的刺激电压下细胞总电流幅度均减小，并且呈电压依赖性，随着去极化电压越大，氯胺酮敏感性电流幅度越大。在-36 mV电压下，K组比N组总电流减少7 pA，在+68 mV膜电压下，该值增大至328 pA，但各个电压下电流减小的比例是一定的(15.5％～17.5％)。与N组相比，K组使外毛细胞反转电位从55.4±3.6 mV去极化至54.9±3.1mV(n=10，t=0.22，P＞0.05)。绘制氯胺酮敏感性电流平均I-V曲线，发现其反转电位为-55.2±6.1 mV，与钾离子平衡电位相近，故推断氯胺酮影响的为外毛细胞上的钾电流。待细胞恢复后，观察这10个外毛细胞在电流钳下100μM/L氯胺酮对细胞静息膜电位的影响，发现10个外毛细胞平均静息膜电位从给药前的-63.5±8.7 mV变化至63.1±9.5 mV，未发生明显变化(P＞0.05)，说明100μM/L氯胺酮不影响外毛细胞静息膜电位。
　　(4)Vh=3 mV下，灌流100μM/L氯胺酮，比较K1、K2、K3三组乙酰胆碱电流，结果显示氯胺酮敏感性电流平均幅度为79±7 pA，乙酰胆碱电流平均幅度为76±18 pA，均与前面结果中一致，说明氯胺酮与乙酰胆碱对外毛细胞上外向电流的影响相互独立，氯胺酮对外毛细胞电流的影响不是通过调节乙酰胆碱流而起效的。
　　(5)Vh=3 mV下，灌流0.1μM/L士的宁，比较S1、S2、S3三组氯胺酮敏感性电流，结果显示，灌流士的宁对外毛细胞电流基线无影响，给药100μM/L氯胺酮，氯胺酮敏感性电流平均幅度为78±13 pA，与前面结果中一致，说明用士的宁阻断α9/α10 nAChR对氯胺酮敏感性电流不产生影响，说明氯胺酮不是通过直接影响外毛细胞上乙酰胆碱受体而起效的。
　　结论:1.氯胺酮可浓度依赖性抑制外毛细胞外向膜电流。2.100μM/L氯胺酮引起外毛细胞I-V曲线-36 mV以上膜电流成比例减小，对外毛细胞反转电位和静息膜电位均无影响，说明氯胺酮不通过改变膜电位来影响外毛细胞电致运动。3.氯胺酮的作用可能为抑制钾电流，结合外毛细胞上离子通道和电流的激活电位，推测该电流为钙离子依赖性钾电流。4.已有研究发现100μM/L氯胺酮可以减小外毛细胞细胞内钙离子浓度，结合本研究，推测氯胺酮可通过减弱外毛细胞细胞骨架上的钙离子依赖性蛋白磷酸化，增强细胞骨架整体轴向劲度，引起胞体伸缩运动阻尼增大而减弱外毛细胞电致运动幅度。

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