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淀粉样前体蛋白及其裂解产物在人卵巢中的表达及其与辅助生殖技术治疗结局的关系

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摘要

前言

第一部分 淀粉样前体蛋白及其裂解产物在人卵巢中的表达及其与卵巢储备和卵巢反应性的关系

前言

材料和方法

实验结果和分析

讨论

小结

第二部分 淀粉样前体蛋白及其裂解产物与辅助生殖技术妊娠结局的关系

前言

材料和方法

实验结果和分析

讨论

小结

第三部分：Aβ40对体外培养大鼠颗粒细胞的增殖及甾体激素生成相关分子的影响

前言

材料和方法

实验结果和分析

讨论

小结

第四部分 体外培养大鼠颗粒细胞中APP过表达对甾体激素生成相关分子的影响

前言

材料和方法

实验结果与分析

讨论

小结

全文小结

参考文献

缩写词简表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明

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摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分:淀粉样前体蛋白及其裂解产物在人卵巢中的表达及其与卵巢储备和卵巢反应性的关系
　　目的:
　　探讨IVF-ET周期中，APP在IVF/ICSI患者卵巢颗粒细胞中的表达及sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40在卵泡液中的表达与卵巢储备、卵巢反应性是否相关。了解APP在人卵巢组织以及小鼠卵巢组织、子宫内膜、骨骼肌的表达情况。
　　方法:
　　1.选择2013年6月至2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心行IVF/ICSI治疗并且使用长方案的患者，排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、有卵巢手术史、严重男方因素性不育的患者，共纳入51例不孕患者。
　　2.用Ficoll梯度离心法分离拾卵后的所有卵泡液、获取颗粒细胞，采用Western blotting方法测定颗粒细胞APP的表达，并进行半定量分析。
　　3.从病理科收集手术切除的人卵巢组织标本，采用免疫组织化学方法检测APP在人卵巢组织中的定位表达。同时采用疫组织化学方法比较APP在小鼠卵巢组织、骨骼肌、子宫内膜的定位表达情况。
　　结果:
　　1.Western blotting结果显示，APP表达于IVF/ICSI患者的卵巢颗粒细胞;ELISA结果显示， sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40存在于IVF/ICSI患者的卵泡液中。
　　2.不孕患者卵巢颗粒细胞的APP相对表达量与AFC之间存在显著负相关，相关系数为-0.448(P＜0.05)，IVF/ICSI患者卵巢颗粒细胞的APP相对表达量与获卵数之间也存在显著负相关，相关系数为-0.467(P＜0.05)。
　　3.免疫组织化学结果显示，APP在人卵巢组织的颗粒细胞、卵丘细胞及卵子呈阳性表达，APP在小鼠卵巢颗粒细胞和卵子、骨骼肌以及子宫内膜均呈阳性表达。
　　结论:
　　1.APP存在于不孕患者卵巢颗粒细胞，sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40存在于不孕患者卵泡液中。且APP与AFC、获卵数之间呈显著负相关，提示卵巢颗粒细胞APP表达与IVF/ICSI患者卵巢储备、卵巢反应性相关。
　　2.不孕患者卵泡液中sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40水平可能与AFC及获卵数无相关性。由于本研究所选标本较少，尚需扩大样本量进一步研究。
　　3.APP在小鼠卵巢组织的颗粒细胞、卵子及子宫内膜阳性表达，提示APP可能与小鼠生育力相关。
　　第二部分:淀粉样前体蛋白及其裂解产物与辅助生殖技术妊娠结局的关系
　　目的:
　　探讨IVF-ET周期中，APP在IVF/ICSI患者卵巢颗粒细胞中的表达及sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40在卵泡液中表达与IVF/ICSI妊娠结局是否相关。
　　方法:
　　1.选择2013年6月至2013年9月于南方医科大学南方医院生殖医学中心使用GnRHa长方案行IVF/ICSI-ET治疗的51例患者，排除多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症、有卵巢手术史、严重男方因素性不育的患者。经拾卵后的所有卵泡穿刺液用Ficoll梯度离心法分离颗粒细胞，采用Western blotting方法测定颗粒细胞APP的表达，并进行半定量分析。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定取卵日卵泡液的sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40水平。记录两原核数、胚胎数、≤5％碎片的8细胞胚胎数、种植率、取消移植率、临床妊娠率等指标。
　　2.数据分析时，首先将51例不孕患者按经IVF-ET治疗是否获得妊娠分为两组，临床妊娠组和非妊娠组，比较两组患者APP及其裂解产物sAPPα、sAPPβ、Aβ42、Aβ40的表达水平是否有统计学差异。
　　3.连续变量进行正态分布性检验，结果用均数±标准差来表示。如果数据是正态分布的话，组间的比较采用t-test或者是One Way ANOVA。如果数据是非正态分布的话，组间的比较采用Wilcoxon Sign Rank test或者是Kruskal-Wallis test。
　　结果：
　　1.妊娠组的Aβ40水平显著高于未妊娠组（228.60±53.21 pg/ml vs.178.90±76.59 pg/ml，P＜0.05）。但是两组的APP、sAPPα、sAPPβ、Aβ42水平无统计学差异。
　　2.Aβ40低、中、高浓度组的妊娠率分别为16.6％(2/12)、59.2％(16/27)、58.3％(7/12)，Aβ40中、高浓度组的妊娠率显著高于低浓度组的妊娠率(P＜0.05); Aβ40低、中、高浓度组的取消移植率分别为9％(1/11)、0％(0/27)、9％（1/11），中浓度组的取消移植率显著低于低浓度和高浓度组的取消移植率(P＜0.05)。
　　3.三组间的两原核数、胚胎数、≤5％碎片的8细胞胚胎数、≤5％碎片的8细胞胚胎数占总胚胎个数的比例无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　卵泡液中恰当浓度的Aβ40水平可能对IVF临床结局有关，尚未发现APP、sAPPα、sAPPβ、Aβ42与IVF妊娠结局有相关性，由于临床样本数有限，需要扩大样本进一步研究。
　　第三部分:Aβ40对体外培养大鼠颗粒细胞的增殖及甾体激素生成相关分子的影响
　　目的:
　　研究不同浓度Aβ40对大鼠颗粒细胞增殖及甾体激素生成过程相关分子表达的影响，以探索Aβ40可能通过何种途径影响卵子发育。
　　方法:
　　体外培养21日龄SD雌性大鼠的卵巢颗粒细胞，分别加入不同浓度(0pg/ml、100 pg/ml、200 pg/ml、300 pg/ml、400 pg/ml)的Aβ40，作用细胞24小时。用CCK-8检测不同浓度组的颗粒细胞增殖状况。用RT-PCR的方法测定巢颗粒细胞中甾体激素生成相关分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR的mRNA水平。
　　结果:
　　1.与对照组比较，200、300、400 pg/ml浓度的Aβ40均能促进大鼠卵巢颗粒细胞增殖（P＜0.05）。200 pg/ml Aβ40对颗粒细胞的促进增殖作用最强(增殖率114.53％)，其次是300 pg/ml Aβ40（增殖率110.06％），100 pg/ml Aβ40和400 pg/mlAβ40对颗粒细胞的促进增殖作用最弱（增殖率分别为106.77％和106.86％）。
　　2.与对照组(0pg/ml Aβ40)比较，200 pg/mlAβ40和400 pg/mlAβ40对FSHR、StAR、P450arom基因表达有促进作用（P＜0.05）;200 pg/mlAβ40对IGF-1、P450scc基因表达有促进作用（P＜0.05），但400 pg/mlAβ40对IGF-1、P450scc基因表达无促进作用(P＞0.05);400 pg/mlAβ40对IGF-1R基因表达有促进作用(P＜0.05)，但200pg/mlAβ40对IGF-1R基因表达无促进作用（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.Aβ40可能通过提高颗粒细胞的增殖能力从而改善了卵子质量、有助于获得临床妊娠。
　　2.Aβ40可能通过提高颗粒细胞中FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR的基因表达从而改善了卵子质量、有助于获得临床妊娠。
　　3.不同浓度的Aβ40对这些分子的调节作用不同。过高浓度的Aβ40可能对卵巢颗粒细胞有负面作用，提示只有适当浓度的Aβ40对颗粒细胞、卵子、妊娠是有利的。
　　第四部分：体外培养大鼠颗粒细胞中APP过表达对甾体激素生成相关分子的影响
　　目的：
　　探讨APP过表达对卵巢颗粒细胞甾体激素生成过程相关分子的影响，以探索APP可能通过何种途径影响卵泡生长。
　　方法：
　　21日龄SD雌性大鼠腹腔注射孕马血清50IU/只，48小时收集卵巢颗粒细胞进行原代培养。培养细胞分为3组:对照组:培养液中不加任何处理因素;空载组:培养液中加入空载质粒及转染试剂Lipo2000; APP过表达组:培养液中加入APP真核表达质粒及转染试剂Lipo2000。Western blotting方法检测APP蛋白表达变化，检测转染效率。APP过表达后，RT-PCR方法检测甾体激素生成相关分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR及凋亡分子Bax、Bcl2的mRNA表达变化。
　　结果：
　　APP过表达后:IGF-1的基因表达明显受抑制(P＜0.05)，其mRNA水平降至约对照组的四分之一;P450arom和P450scc的基因表达明显增加(P＜0.05)，其mRNA水平上调至对照组的约15倍;StAR的基因表达明显增加(P＜0.05)，其mRNA水平上调至对照组的约7倍;IGF-1R和FSHR的基因表达明显增加(P＜0.05)，其mRNA水平约上调至对照组的约2倍;Bax、Bcl2的基因表达明显增加(P＜0.05)，其mRNA水平约上调至对照组的约2倍。
　　结论：
　　APP过表达可能通过影响颗粒细胞细胞中甾体激素生成相关分子FSHR、IGF-1、IGF-1R、P450 arom、P450scc、StAR及凋亡Bax、Bcl2的基因表达影响卵泡生长。

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