• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >肝细胞癌中CYPs酶蛋白的变化与代谢活性及其对药物处置能力的相关性研究
【6h】

肝细胞癌中CYPs酶蛋白的变化与代谢活性及其对药物处置能力的相关性研究

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

摘要

第一章 前言

1．1 原发性肝细胞癌研究概况

1．1．1 HCC流行病学特征

1．1．2 HCC病因与易感因素

1．1．3 HCC临床诊断及治疗

2．2 原发性肝细胞癌与药物代谢酶的关系研究概况

2．2．1 药物代谢酶研究进展

2．2．2 药物代谢酶与肿瘤发生及药物治疗的关系

2．3 立题依据

2．3．1 研究意义

2．3．2 研究目标

第二章 临床组织样本纳入及处理方法

2．1 临床病例信息及纳入标准

2．2 仪器与试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．3 HCC肝组织微粒体的制备

2．3．1 所需溶液配制

2．3．2 肝微粒体制备流程

2．3．3 肝微粒总蛋白测定

2．4 HCC肝组织总RNA的提取

2．4．1 所需溶液配制

2．4．2 肝组织总RNA提取流程

2．4．3 cDNA的合成

第三章 HCC肿瘤组织中CYPs和UGTs蛋白表达变化研究

3．1 引言

3．2 仪器与试剂

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 LC-MS／MS测定肝组织蛋白基本原理

3．3．2 计算机辅助探针多肽设计

3．3．3 探针多肽合成及纯度检测

3．3．4 建立探针多肽LC-MS／MS检测方法

3．3．5 建立肝微粒体蛋白水解方法

3．3．6 建立固相萃取方法

3．3．7 方法学验证

3．3．8 测定HCC肿瘤组织及癌旁组织微粒体中CYPs和UGTs蛋白绝对含量

3．3．9 数据处理及统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 混合肝组织微粒体中CYPs及UGTs代谢酶蛋白表达特征

3．4．2 个体肿瘤组织与癌旁组织CYPs和UGTs蛋白差异性表达

3．5 讨论与结论

第四章 HCC肿瘤组织中CYPs酶活性及其对抗肿瘤药物处置能力变化研究

4．1 引言

4．2 仪器与试剂

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 所需溶液配制

4．3 HCC肿瘤组织中CYPs酶代谢活性变化研究

4．3．1 CYP1A2探针底物非那西丁的酶代动力学研究

4．3．2 CYP2A6探针底物香豆素的酶代动力学研究

4．3．3 CYP2C8探针底物紫杉醇的酶代动力学研究

4．3．4 CYP2C9探针底物甲苯磺丁脲的酶代动力学研究

4．3．5 CYP2D6探针底物右美沙芬的酶代动力学研究

4．3．6 CYP2E1探针底物氯唑沙宗的酶代动力学研究

4．3．7 CYP3A4探针底物睾酮的酶代动力学研究

4．3．8 HCC肿瘤组织中CYPs代谢酶蛋白分子催化能力变化研究

4．4 HCC肿瘤组织中CYPs酶对抗癌药物处置能力变化研究

4．4．1 HCC肿瘤组织对索拉菲尼处置能力变化研究

4．4．2 HCC肿瘤组织对替加氟处置能力变化研究

4．5 讨论与结论

第五章 HCC肿瘤组织中CYPs酶mRNA表达变化研究

5．1 引言

5．2 仪器与试剂

5．2．1 主要仪器

5．2．2 主要试剂

5．3 实验方法

5．3．1 PCR引物设计与合成

5．3．2 荧光实时定量PCR

5．3．3 数据处理及统计学分析

5．4 实验结果与讨论

第六章 CYPs酶活性、蛋白和基因表达水平相关性分析

6．1 实验方法

6．1．1 数据处理方法

6．1．2 统计学分析

6．2 实验结果

6．2．1 CYPs酶活性、蛋白和基因表达水平相关性分析

6．2．2 CYPs酶对抗癌药物处置能力与其表达水平相关性分析

6．2．3 CYPs酶各亚型表达水平相关性分析

6．3 讨论与结论

第七章 结论和展望

参考文献

缩略词

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明

展开▼

摘要

目的:
　　肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是临床上常见的高致死率恶性肿瘤，5年死亡率超过90％，仅次于肺癌和胃癌。我国是HCC高发地区，每年发病人数占全世界发病率50％。乙肝病毒(HBV)感染是HCC最主要的诱发因素之一，而我国HBV感染率高达58％，全国病毒携带者总数超过1亿。因此，HBV诱发的肝细胞癌已成为我国最重要的公共健康问题之一。手术是治疗HCC的首选方法。但是，由于诊断技术限制，80％的患者确诊时通常已失去手术治疗机会。因此，对于绝大多数HCC患者，安全有效的药物治疗极其重要。
　　细胞色素P450酶(CYPs)和葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)是肝脏最主要的药物代谢酶，广泛参与了各种抗肿瘤药物的代谢，从而影响肿瘤及癌旁正常细胞对药物的敏感性。同时，这些代谢酶还参与了各种（前）致癌物质的活化和灭活，与肿瘤的发生和发展密切相关。多数抗肿瘤药物在对肿瘤产生毒性作用的同时也会对正常组织造成损伤。临床上使用这些药物对HCC患者进行治疗时很难预测药物对肿瘤的杀伤效能及对周围组织的毒副作用。其主要原因是代谢酶的个体差异及其在HCC疾病状态下活性和表达的变化，造成了药物在体内动力学和药效学的改变。因此，系统地阐明HCC状态下CYPs和UGTs酶的表达及活性变化，对抗肿瘤药物的合理使用及对治疗效果的预估意义重大。另外，由于CYPs和UGTs酶的表达存在很大的个体差异，临床上很难对每个患者肝组织中代谢酶的变化做出准确判断。因此，建立灵敏便捷的定量检测方法对个体中CYPs和UGTs酶的代谢能力进行监控，对于HCC个体化治疗具有重要意义。
　　方法:
　　本研究共采集26例中低分化HCC患者肝组织样本，对肿瘤组织和癌旁组织中CYPs和UGTs代谢酶的表达差异进行了系统研究。具体过程如下:
　　采用差速离心法分别提取个体肿瘤组织及癌旁组织微粒体蛋白。建立LC-MS/MS蛋白定量方法，利用非同位素标记探针多肽对各样本中7种CYPs亚型及5种UGTs亚型进行绝对定量，考察HCC肿瘤与癌旁组织中各种代谢酶的蛋白表达差异及其变化规律。
　　建立肝微粒体体外代谢模型，采用探针底物法对HCC肿瘤组织及癌旁组织中7种CYPs酶代谢活性进行评价。同时，测定抗癌药物索拉菲尼及替加氟在肿瘤及癌旁组织样本中的酶代动力学参数，考察HCC肿瘤组织对治疗药物处置能力的变化。
　　提取HCC患者肝组织总RNA，采用Real-Time PCR方法研究肿瘤及癌旁组织中各CYPs亚型mRNA表达差异，阐明HCC肿瘤中CYPs蛋白及活性变化的初步原因，为进一步从转录水平研究其具体分子机制提供参考。
　　结果:
　　1.HCC肿瘤组织中CYPs和UGTs蛋白表达变化研究
　　本研究建立了一种准确、稳定、灵敏的LC-MS/MS方法可同时对人肝微粒体中7个CYPs和5个UGTs亚型进行绝对定量。利用这个方法，我们首次对HCC肿瘤组织及癌旁组织中CYPs和UGTs酶的蛋白绝对含量进行了测定。结果表明，与癌旁组织相比，80％以上患者肿瘤组织中CYPs蛋白表达水平显著降低。其中CYP1A2平均蛋白表达降低了20倍(34.4±14.3 vs1.8±1.6 pmol/mgmicrosomal protein)，CYP3A4(34.8±16.5 vs5.5±8.9)、2D6(13.9±9.0vs3.8±2.6)、2C8(56.0±26.9vs6.1±5.1)、2C9(85.0±35.4vs8.4±9.0)和2E1(30.0±13.0 vs7.7±11.8)降低了4-10倍，而CYP2A6仅降低了2倍(12.3±8.5vs6.5±17.1)。
　　在正常人肝微粒体中(rHLMs-pooled)，CYP2E1蛋白表达水平最高(30％)，其次为CYP2C9(21％)和CYP2C8(14％)。CYP3A4和CYP2D6是CYPs家族中最重要的两个亚型，参与了市场上50％药物代谢。但是，其蛋白表达比例仅为14％和5％。正常人肝微粒体中UGTs家族各亚型蛋白表达量差异较小。其中CYP1A4表达最高（占29％）。而主要参与药物等外源性物质代谢的亚型UGT1A1和UGT1A9也占了36％。HCC患者癌旁肝组织微粒体(nHLMs-pooled)中CYPs和UGTs各亚型的比例与正常人没有显著的差异。但是，HCC肿瘤组织中代谢酶的蛋白表达比例出现了较大变化。UGT1A6在癌旁组织或正常肝组织中只占9～13％，而在肿瘤组织中，UGT1A6蛋白表达比例升高到38％。相反，肿瘤中UGT2B7表达比例从原来的22％降到了8％，同时UGT1A4也明显降低（由38％降到22％）。CYP2A6蛋白表达比例在HCC肿瘤组织中明显增高，而CYP3A4和CYP1A2明显降低，其他亚型比例与正常组织相当。
　　本研纳入的25例肝组织样本中CYPs和UGTs表达具有很强的个体差异性，这种特征与文献报道一致。癌旁组织中CYP1A2和UGT2B7个体间表达差异高达52和39倍。CYP3A4、2D6、2C9和UGT1A1、1A9等与药物代谢密切相关的亚型在个体间表达差异为4-17倍。本研究定量结果还发现，HCC肿瘤中各种CYPs和UGTs亚型的蛋白表达也表现出了很强的个体差异性。而且由于肿瘤细胞对代谢酶调节机制存在个体差异，很多亚型在个体肿瘤组织间的表达差异性远大于癌旁组织。CYPs和UGTs代谢酶对于各种外源性物质包括抗癌药物的活化或灭活具有重要作用。而这些代谢酶表现出的个体化差异会使得药物在个体代谢出现很大差异，从而使给予不同个体相同剂量药物时，产生截然不同的治疗作用或毒性作用。这种因人而异的治疗差异会严重影响临床疾病如肝癌的药物治疗。因此，针对CYPs和UGTs表达差异的个体化治疗方案对于肝癌的治疗将会有重要意义。
　　2.HCC肿瘤组织中CYPs酶代谢活性及其对抗肿瘤药物处置能力变化研究本研究系统的阐明了HCC肿瘤组织及其癌旁组织中7种CYPs亚型对探针底物代谢能力的变化特征。酶代动力学研究结果表明，与癌旁组织相比，HCC肿瘤组织中各种CYPs亚型对探针底物的清除速率均显著降低。其中，CYP3A4和CYP1A2降低了20倍以上，CYP2D6、2C8、2C9和2E1降低了8倍，而CYP2A6仅降低了2倍。个体研究结果也显示CYPs酶的代谢活性在80％以上患者肿瘤组织中降低了3倍以上。但也有部分肿瘤中CYPs活性未发生显著变化，甚至出现增高，提示HCC肿瘤对CYPs活性的调控机制具有个体化差异。这些结果与HCC肿瘤组织中CYPs蛋白表达变化趋势高度一致。说明肿瘤组织中CYP酶代谢速率的改变可能是由于蛋白含量变化所引起。另外，引起代谢速率改变的另一个原因是代谢酶蛋白分子本身催化能力的改变。本实验通过计算CYPs酶对探针底物的转化速率(TON)评价各CYPs亚型的催化能力。结果显示，肿瘤组织中，除了CYP2C9和CYP2D6催化能力轻微变化（小于2倍），其他CYPs亚型催化能力均与癌旁组织和正常组织无显著性差异。酶动学研究也表明肿瘤组织、癌旁组织和正常人肝组织中各种探针底物代谢的Km值都没有明显差异，并且表现相同的动力学特征。这些结果提示HCC肿瘤组织中CYPs酶蛋白分子基本特征并没有显著改变，CYPs酶代谢速率的改变并不是由于催化能力降低引起。
　　3.HCC肿瘤组织中CYPs酶mRNA表达变化研究
　　本研究采用Real-Time PCR对HCC患者肿瘤组织及对应癌旁组织中7种CYPs酶亚型mRNA表达水平进行了定量研究。结果显示各种CYPs亚型在肝肿瘤组织及癌旁组织中均有表达。通过对比发现，大多数肿瘤组织中CYPs各亚型mRNA表达水平较癌旁组织均出现显著降低。与癌旁组织相比，肿瘤组织中CYP3A4 mRNA平均表达水平降低了23倍。CYP2C8、2C9和2E1也降低了6-7倍。
　　4.CYPs酶蛋白的变化与代谢活性及其对药物处置能力的相关性研究
　　分别采用LC-MS/MS蛋白定量方法及探针底物法测定HCC患者肝组织微粒体中7种CYPs酶蛋白表达及其代谢活性，并进行相关性分析。结果显示，HCC肿瘤组织及癌旁组织中CYPs酶代谢活性与其蛋白表达水平具有高度相关性。其中CYP2A6和CYP2D6的活性和蛋白表达相关性最强，相关系数大于0.9。此结果进一步说明了HCC患者肝组织中CYPs酶代谢活性的改变主要是由蛋白表达变化造成。另外，HCC肿瘤组织和癌旁组织中CYPs活性与其蛋白表达水平线性回归斜率相似，说明两种组织中CYPs酶蛋白分子催化活力相当。以上结果提示，测定HCC患者肝组织中CYPs代谢酶的蛋白含量可有效地对其活性变化进行评价，从而预测药物在HCC患者肝组织中的代谢速率。
　　结论:
　　综上所述，HCC肿瘤中CYPs酶代谢活性显著降低，其主要原因为CYPs酶蛋白及mRNA表达水平下调所致，而酶蛋白分子催化能力并未显著改变。HCC肿瘤组织中CYPs表达的变化可显著改变索拉菲尼和替加氟等抗癌药物的代谢速率，推测可能会对药物疗效和毒性产生重要影响。本研究建立了一种快捷稳定的LC-MS/MS方法可同时测定HCC肿瘤和癌旁组织中各种CYPs和UGTs蛋白绝对含量。利用此方法可准确的对患者肝组织各种代谢酶活性进行评价，从而对肿瘤组织和癌旁组织中药物活化或灭活速率进行预测。我们期望本研究可为HCC患者合理用药，提高药物治疗作用而降低毒副作用提供新的方法和思路。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号