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实验性阿尔茨海默氏病大鼠淀粉样变性脑血管病变的病理学研究

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第一章 实验性阿尔茨海默氏病大鼠模型的制备

1．研究目的

2．实验材料和方法

3．结果

4．讨论

第二章 实验性阿尔茨海默氏病大鼠脑血管淀粉样变性的病理学研究

1．研究目的

2．实验材料和方法

3．结果

4．讨论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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摘要

研究背景:阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease，AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变，是老年期痴呆的最常见类型，约占老年期痴呆的50％以上。临床上表现为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间能力损害、抽象思维和计算能力损害、人格和行为的改变。AD的临床症状大致可分为两方面，一方面为认知功能减退及其伴随的生活能力减退症状，另一方面表现为非认知性神经精神症状。目前AD的发病原因及发病机制仍未明确清楚，目前存在着多种假说，各种假说均有一定的研究证据支持，亦有该假说无法解释清楚之处。据文献报道，目前AD发病机制的假说主要有以下几种:蛋白的异常（主要为Aβ蛋白及Tau蛋白）、神经递质的异常消耗、胰岛素抵抗(IR)、基因突变（主要为APP基因、PS基因及ApoE基因）、神经炎症假说等。 但是，由于AD的特征性神经病理学变化和脑微循环障碍导致的脑能量代谢障碍密切相关，因此，越来越多的研究表明，AD是一种血管性疾病，由此认为AD应该被归类为血管性疾病。目前，AD的血管机制被越来越多的科学家提到首要位置。 大量的流行病学研究显示，包括Rotterdam的大量人群调查，血管危险因素对于老年人的认知障碍的发病起着重要的作用，老龄、动脉硬化、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、高同型半胱氨酸等都是VaD和AD的危险因素。众多危险因素均影响脑内血流动力学，导致脑低灌注，脑低灌注影响脑代谢改变、血脑屏障内皮细胞生理功能失常等一系列变化过程的结果。小的缺血性梗死虽然理论上能引起痴呆，但是一般临床表现并不明显，但是伴有AD病理改变的脑缺血性梗死，其临床表现则较没有AD病理表现的病例要明显。 相较于外周的血管系统，脑内的血管系统具有其自身特有的解剖结构。脑内的大动脉分支成很多小动脉和微动脉，这些小动脉和微动脉穿通于脑表面。这些小动脉和微动脉由多种细胞组成，包括上皮细胞层、平滑肌细胞层、外层软脑膜细胞层即血管外膜，血管周围间隙将这些神经血管单元与脑组织分开。 血管周围间隙(Perivascular spaces，PVS)也被称为威尔肖-罗宾间隙(Verchow-Robin spaces，VRS)是包绕在动脉和静脉血管周围的微小组织间隙，VRS将血管与周围的脑组织分离开来，是神经系统内的正常解剖结构。目前研究认为，VRS是脑组织内淋巴循环的主要组成部分，构成“淋巴管前淋巴系统”，脑组织中的淋巴液主要经动脉周围的VRS引流至双侧颈深淋巴结，由此可见，脑淋巴循环和颅外淋巴循环明显不同，脑淋巴循环系统中没有被覆上皮的淋巴管，代之以围绕在血管周围的VRS，血管壁成为脑血液循环和脑淋巴循环共享的解剖结构，血管壁的病变不仅影响脑血液循环，同时也可导致脑淋巴循环障碍。 目前已经有明确的证据表明，在AD病人脑中，Aβ的生成和清除不平衡，导致Aβ在脑血管壁上的沉积。Aβ主要有Aβ1-40和Aβ1-42两种，Aβ1-42更容易发生沉积，是老年斑内淀粉样蛋白的主要成分，但Aβ1-40更容易在血管周围沉积。Aβ从可溶性多肽到不可溶淀粉样纤维的转变是导致脑内沉积的关键。可溶性Aβ多肽生成后分泌到细胞外，积累到一定程度后就自发聚合形成可溶性的寡聚体、原纤维和其他形式中间体，在特定条件下能够以多肽链间的β-片状折叠形式聚集形成不可溶淀粉样纤维（Aβ纤维），极易在脑组织中沉积形成淀粉样斑块。Aβ纤维和Aβ寡聚物均具有神经毒性，是导致AD发生的主要原因。 脑血管淀粉样变性(cerebral amyloidangiopthy, CAA)是一种以大脑皮质及软脑膜的中小血管壁内淀粉样物质沉积为特征的颅内血管病，中小动脉最常受累，静脉和毛细血管受累较少受累，其淀粉样沉淀物主要为淀粉样β蛋白(Amyloid beta-protein，Aβ)。AD患者脑组织中的产生的Aβ通过动脉周围VRS引流过程中容易在局部沉积，主要沉积在皮层内和软脑膜下小动脉周围的VRS及其附近的结构（主要是血管壁和星形胶质细胞胶质界膜），逐渐在局部形成淀粉样斑块，导致CAA。反之，CAA形成后还可阻塞VRS，导致脑淋巴循环障碍。 因此，本研究拟采用立体定向双侧大鼠海马内注射Aβ纤维制备AD动物模型，观察动物的发病过程的行为学改变和病理学变化，在此基础上进行双重标记免疫荧光，探讨淀粉样蛋白在脑组织内沉积的规律，并观察脑组织的病理变化及CAA的动态变化特点。 方法: 1、实验动物及分组:SD大鼠40只，随机分为模型组和假手术对照组，各20只，每组各分为4个亚组:1w、2w、4w、12w，每个亚组各5只。 2、Aβ1-42纤维制备:将Aβ1-42溶于灭菌PBS溶液中(1μg/μL)，并将其置于37℃恒温水浴摇床中，振荡水浴7天即可熟化成Aβ纤维，用于制备AD模型。 3、AD动物模型制备:将40只大鼠随机分为模型组和假手术对照组，各20只，每组各分为4个亚组:1w、2w、4w、12w，每个亚组各5只，模型组大鼠采用立体定向技术大鼠双侧海马内注射10μL已经制备好的Aβ纤维，对照组大鼠则采用采用立体定向技术大鼠双侧海马内注射等量灭菌PBS。 4、Morris水迷宫试验:实验组及对照组大鼠的4w和12w亚组在造模后相应时间点进行Morris水迷宫试验。 5、取材:各组大鼠分别于术后相应时间点采用灌注固定，留取脑组织标本，并液氮速冻后置于-80℃低温冰箱保存。 6、病理学染色:各组大鼠脑组织分别行连续冰冻切片，并行HE染色、刚果红染色，并以间接免疫荧光法双重标记Aβ纤维及α肌动蛋白。 7、统计分析:Morris水迷宫测试结果以均数±标准差（(x)±s）表示，潜伏期统计方法采用重复测量方差分析，穿越平台次数统计方法采用单因素方差分析。采用SPSS11.0软件进行统计分析，P＜0.05为显著性差异。 结果: 1、Morris水迷宫实验:经过4天的训练，各亚组大鼠的逃避潜伏期时间均逐渐缩短。分别对比4w及12w亚组大鼠可见，模型组大鼠每天的逃避潜伏期均较假手术对照组长(P＜0.05);对比总的逃避潜伏期，模型组大鼠的逃避潜伏期与假手术对照组时间之间存在显著性差异(P＜0.001)。对比大鼠穿越平台次数的变化，4w及12w亚组大鼠，模型组大鼠穿越平台次数较假手术对照组减少（P＜0.05）。 2、HE染色:实验组大鼠脑组织切片可见海马区颗粒细胞减少，细胞变性，椎体细胞增生，细胞核深染，海马内小血管血管壁变性;大脑皮层处可见神经细胞肿胀、变性、坏死，少量可见吞噬细胞吞噬。随着时间推移，上述病理表现逐渐增多，对照组HE染色未见明显病理性改变。 3、刚果红染色:刚果红染色显示，模型2w组可见淀粉样蛋白开始在海马小血管周围脑组织中聚集，模型4w组可见小血管周围有淀粉样蛋白沉积;模型12w组可见大量淀粉样蛋白沉积在小血管壁，管壁增厚，小血管狭窄或闭塞。假手术对照组术后各亚组均未见明显淀粉样蛋白沉积。 4、免疫荧光染色:双重染色标记Aβ和α-actin后在荧光显微镜下观察可见:模型1w组及2w组海马内有少量Aβ纤维沉积，但小动脉周围未见Aβ纤维沉积;模型4w组可见少量Aβ纤维分布在小动脉（α-actin染色阳性的血管）周围;模型12w组海马内聚集在小动脉周围的Aβ纤维较模型4w组明显增多。 结论: 1、本研究采用立体定向大鼠双侧海马内注射Aβ纤维制备AD动物模型，经过Morris水迷宫进行动物行为学实验，发现实验组大鼠的水迷宫逃避潜伏期时间明显较对照组大鼠的水迷宫逃避潜伏期时间明显延长，进行HE及刚果红染色可发现，实验组大鼠脑组织内可见AD样病理性改变，血管可见均一无结构的淀粉样物质沉积。经上述实验可证实，本研究的阿尔茨海默氏病的动物模型基本成功，可用于进一步的实验研究。 2、水迷宫实验显示实验组大鼠的学习记忆能力较对照组明显下降，表明实验组大鼠的高级认知功能发生了明显的损害。 3、刚果红染色实验组各亚组的大鼠脑组织内及海马区内的小血管闭上均可见淀粉样蛋白沉积，且随着时间推移，淀粉样蛋白沉积越明显，对小血管壁的影响也越大。 4、Aβ及α-actin标记的双重免疫荧光染色显示淀粉样蛋白在实验组各亚组的大鼠脑组织内存在则动态的迁延过程，实验组大鼠脑组织内可见β-淀粉样蛋白从大鼠脑组织实质内逐渐缓慢向脑内小血管迁移，输将向小动脉壁周附着，可导致小血管发生病理性改变，出现小动脉的不同程度的狭窄甚至闭塞，可导致大鼠脑组织内血流量的下降，导致CAA的发生。 5、本研究通过立体定向双层海马内注射Aβ纤维制备AD动物模型，明确了CAA是AD的主要病理学变化。

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