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小鼠和人鼻咽发育形态学与免疫组织化学研究

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摘要

前言

参考文献

第一部分 小鼠与人胚胎鼻咽发育形态学比较研究

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 人胚鼻咽发育nestin表达的免疫组化学研究

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 Nestin转基因小鼠咽喉部增生性变化的研究

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文小结

成果

致谢

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摘要

第一部分小鼠和人胚胎鼻咽发育形态学比较研究
　　 鼻咽是呼吸道的一部分，位于蝶骨体和枕骨基底部的下方，呈不规则的立方形。人鼻咽有六壁:前壁、后壁、顶壁、底壁及两侧壁。鼻咽壁的组织结构分为4层:粘膜层、粘膜下层、肌层及外膜。粘膜由上皮及固有膜构成;上皮有清晰的基膜，将上皮与固有膜分开。鼻咽部常见的疾病很多，如慢性咽炎;良性肿瘤如咽部乳头状瘤、腺瘤等;恶性肿瘤如鼻咽癌。
　　 迄今为止，对正常鼻咽粘膜的形态认识尚有许多分歧。例如对鼻咽复层鳞状上皮的来源，目前主要有2种观点;1、复层鳞状上皮在出生的时候已经存在，属于正常的上皮。2、复层鳞状上皮是在出生后由假复层纤毛柱状上皮化生形成。造成认识分歧的主要原因是难以获取珍贵的人体材料。
　　 小鼠是生命科学研究首选的动物模型。研究显示，鼠类99％的基因与人类相同，其胚胎的发育过程与人胚胎发育过程有许多相同之处。而且小鼠妊娠时间短，产量高，可以方便的给胚胎发育研究工作提供生物材料。
　　 目前，对人胚胎鼻咽部发育的研究较少，而对小鼠胚胎鼻咽部发育的研究尚未有报道。本文从发育及形态学角度研究人、小鼠胚胎鼻咽解剖学与组织学差异，为鼻咽疾病的研究提供组织学依据。
　　 材料与方法：
　　 收集水囊引产的妊娠E9-28W（周）人正常胎儿鼻咽组织共23例;人胚胎来自合法流产，米索针剂（前列腺素类）引产的正常胎儿。根据孕妇提供末次月经时间结合测量胎儿的顶跟径长度及手足形态，核实胎龄，性别不拘。另取C57BL/6J小鼠妊娠E9.5-19.5D（天）正常胎儿，每个妊娠天取材3例，共33例。小鼠每日下午4-6时交配，第二天早上8时，通过检查阴栓或精子涂片判断小鼠是否受精。受精成功后，判断为种鼠妊娠第一天，即日龄为0.5天。取材实验标本时，在离体4小时内，将整个鼻咽部连同软腭一同切下。胚胎组织用Bouin氏固定液固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4-6μm连续切片，H.E染色。从前壁向口咽方向，每隔50微米取一张切片，每张切片的每个壁上各取10个视野（不足10个视野的取全壁），光学显微镜下记录鼻咽的结构，上皮的形态、厚度，细胞层数及粘膜下腺体的形态、出现时间等情况。
　　 结果：
　　 人胚胎鼻咽部在E9W时已经形成。鼻咽部呈不规则的立方形，顶后壁呈约120°的弧形;鼻咽部富含皱襞、隐窝及淋巴组织。小鼠胚胎鼻咽部在E15D形成，它是一个接近直线的弧形管腔，未见淋巴组织及隐窝等结构。
　　 人与小鼠胚胎鼻咽部粘膜分化过程相似。鼻咽粘膜的分化具有规律性，但是不同部位粘膜细胞分化不同步。近侧鼻咽部粘膜发育较早，远侧鼻咽部粘膜发育较晚。后壁、侧壁粘膜发育较早，顶壁粘膜发育最晚。但与小鼠胚胎相比，人胚胎的鼻咽部发育成熟相对较早。人胚胎在发育到胚胎期的1/4时(E9W)，就已经形成完整、独立的鼻咽部。而小鼠胚胎则需要到胚胎发育期的3/4时(E15D)，才形成鼻咽部。小鼠胚胎的鼻咽部假复层纤毛柱状上皮在出生前才完全分化，而人鼻咽胚胎粘膜在胚胎发育中期(E21W)时就已经基本分化完全。同时，鼻咽部的一些组织发育也同样如此，例如粘膜下腺体。人胚胎在E11W时，在粘膜下层已经开始分化形成腺体。胚胎发育至E17W，部分腺体已经形成腺泡样结构，可以清晰的分辨出腺体的类型。E21W以后，大部分腺体已经形成成熟腺体结构。而小鼠胚胎在E17.5D时方开始形成腺体。出生前，腺体尚未发育成熟。
　　 E13-28W，人胚胎鼻咽粘膜存在3种类型上皮:大部分是假复层纤毛柱状上皮，少量是过渡型上皮和未角化的复层鳞状上皮。过渡型上皮细胞群主要位于后壁、侧壁及顶后壁交界处。复层鳞状上皮位于前壁。鼻咽部主要有两种不同类型过渡上皮。两类上皮在浅层或者深层有不同程度的鳞状细胞化生现象。过渡上皮所在部位向鼻腔方向，为假复层纤毛柱状上皮;向口咽方向为复层鳞状上皮。过渡上皮细胞形态多样，存在细胞向基底膜面深入生长现象。小鼠胚胎鼻咽粘膜在E19.5D时全部为假复层纤毛柱状上皮。人胚胎从E13W开始，在鼻咽部侧壁及顶侧壁交界处就已经出现杯状细胞存在。小鼠的整个胚胎期，鼻咽部粘膜都未发现有杯状细胞存在。
　　 结论
　　 1、人胚胎鼻咽部E21W（中期）已基本发育完善，小鼠胚胎鼻咽粘膜在出生前才分化完成。与人胚胎鼻咽部发育相比，小鼠胚胎鼻咽部发育成熟相对较晚。
　　 2、人与小鼠胚胎鼻咽解剖学和组织学差异明显，可能导致他们对某些疾病易感性及对疾病的抵抗能力不同。
　　 3、过渡上皮的细胞形态多样，存在细胞向基底膜面深入生长及鳞状化生现象，提示过渡上皮细胞的分化受内外胚层分化因素共同调控，性状不稳定。此外，过渡上皮存在的部位可能是内外胚层来源的组织的分界线。
　　 第二部分人胚胎鼻咽发育nestin表达的免疫组化学研究
　　 目前研究发现，许多组织中都存在多潜能的干细胞。尽管对干细胞的确切定义仍存在很多争议，但目前普遍认为干细胞是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的无性系细胞群体。多能干细胞群体可以稳定增殖并保持分化潜能。通过非对称分裂的方式，干细胞产生一个与亲代完全相同的细胞、另一个可以编程为其他细胞类型的细胞。鼻咽粘膜上皮细胞终身不断自我更新，是依靠干细胞持续增殖、分化以取代终末分化细胞来完成。同时，鼻咽是人体与外界相通的要道，具有重要的防御、呼吸、吞咽、发声共鸣等功能。由于与环境之间直接接触，鼻咽部很容易受到致病因子的侵袭。因此，鼻咽粘膜组织经常处于微小的损伤过程中。在鼻咽部受到损伤后，干细胞分裂加速，起到促进创伤修复的作用。
　　 研究者们普遍认为在鼻咽部的不同部位存在着一群具有干细胞特征的细胞亚群。通过研究发现，鼻咽部确在一群具有增殖、分化潜能的细胞，但由于鼻咽部解剖学结构和功能复杂，细胞种类繁多，干细胞研究进展缓慢。对如何识别鼻咽部的多潜能的干细胞一直是人们努力探索和研究的难题。目前尚缺乏有效的手段来鉴定鼻咽上皮干细胞，这成为临床应用干细胞治疗鼻咽部疾病的障碍。
　　 目前，发现和鉴定干细胞的方法主要是通过鉴定细胞是否存在干细胞的特异性标记物。大部分的干细胞的发现都归功于标记物的使用。但是，目前尚未有关于正常鼻咽部干细胞特有的标记物的相关报道。Nestin是神经干细胞的标记物。同时，在胚胎发育早期，多种组织也强烈表达nestin。我们课题组在前期研究中发现，nestin在鼻咽癌组织中高表达。近年来研究发现，组织癌变的过程，常常表达胚胎发育过程中出现的蛋白，这些蛋白在成熟的组织中表达极少。利用这些蛋白作为肿瘤分子标志物，已被应用到肿瘤的早期诊断以及疗效、预后评价。
　　 Nestin可否作为鼻咽部干细胞标记物之一？带着这一问题我们靶定nestin作为研究目标，研究人胚胎鼻咽发育过程中nestin表达情况，对鼻咽部发育过程中的干细胞进行鉴定。初步了解nestin与鼻咽发育的关系，明确nestin是否可以作为鉴定鼻咽干细胞的标记物及鉴定方法，为胚胎鼻咽发育的分子水平调控机制的深入研究提供组织学依据。
　　 材料与方法：
　　 取材E9-28W人胚胎的鼻咽部材料（见第一部分）。用免疫组织化学法检测人鼻咽部nestin表达情况。免疫组织化学法采用SP法，一抗使用鼠抗人单克隆抗体，抗体稀释度为1∶800。取nestin阳性组织切片，E11W人胚脑组织，作为阳性对照。
　　 结果：
　　 E9-28W人胚胎鼻咽粘膜未发现nestin阳性细胞存在。Nestin阳性细胞存在于粘膜下部分未分化完全的腺体细胞、毛细血管内皮细胞及几乎全部肌肉组织的细胞质中。胚胎发育不同时期，nestin在鼻咽部中的表达呈现动态变化。E11W时，可检测到nestin首先在粘膜下肌肉组织及毛细血管内皮细胞中呈阳性染色，阳性细胞数目稀少;随着肌肉组织的发育及毛细血管增多，nestin阳性细胞逐渐增多。E13W开始，在粘膜下腺体中检测到部分腺体细胞呈强阳性染色。E11-28W，几乎所有肌母细胞nestin染色始终处于强阳性状态，无明显减弱。粘膜下腺体在E17W时nestin阳性细胞最多。伴随着腺体逐渐成熟，腺体干细胞进一步分化，nestin表达逐渐减弱。E21W以后，只有少量nestin阳性的腺体细胞。
　　 结论：
　　 1、人胚胎发育的E17W是鼻咽发育最旺盛的时期。此时，上皮生长迅速，过渡上皮开始分化为两类形态不一的过渡上皮（见第一部分），而腺体中nestin阳性细胞数量达到高峰。上皮细胞及腺体前体细胞的生长发育都达到空前活跃。
　　 2、Nestin是人胚胎鼻咽部干细胞的标记物之一。它在人胚胎期鼻咽部的多种组织中表达，与鼻咽的发生和发育密切相关。但未能证明nestin与粘膜上皮的发育相关。可能与取材的时间有关，不能排除在鼻咽发育的更早的时间有nestin的表达。
　　 第三部分Nestin转基因小鼠咽喉部增生性变化的研究
　　 Nestin属于Ⅵ型中间纤维丝蛋白，约220-250kDa。它在胚胎发育早期过程中，在神经外胚层组织强烈表达，随着组织发育分化，nestin表达逐渐减少，故以它作为神经于细胞的标记物。在胚胎发育早期，多种组织也强烈表达nestin。在成体组织中，nestin只在部分具有分化潜能的细胞中表达，如在皮肤、心血管再生过程中表达增高。Nestin在多种肿瘤组织中表达增加，蛋白表达量与肿瘤的恶性程度成正相关。
　　 体外研究表明，nestin能增强细胞的增殖和存活能力。Nestin和糖皮质激素受体结合后使磷脂酰肌醇3激酶活性增强，通过下游的一系列酶促反应促进神经祖细胞进行有丝分裂，使细胞增殖。在永生化的神经祖细胞系ST15A细胞中，过表达nestin可以对H2O2造成的细胞损伤起保护作用。Nestin通过Cdk5/p35信号通路，增强细胞生存能力，抑制凋亡发生。但也有体外研究发现，nestin与增殖无直接相关。在nestin被siRNA抑制表达之后，培养的成神经瘤细胞与星形细胞瘤细胞生长减弱，但细胞ki67的表达并不减少。
　　 同时，nestin在体内的确切功能并没有明确。通过对nestin基因敲除小鼠的研究表明:在nestin+/-基因型的杂合子小鼠中，虽然nestin的表达量大幅减少，但并不引起明显的小鼠发育异常。说明nestin的表达量减少，可能并不影响小鼠的发育和生存。但纯合子小鼠，即nestin-/-基因型的小鼠，在胚胎发育过程中出现神经管发育缺陷并致死。Nestin缺失引起神经管细胞大量凋亡，导致凋亡的作用和nestin的细胞骨架功能无关。这说明nestin的存在对维持神经干细胞的生存和自我更新是必须的，而缺乏nestin对神经干细胞的增殖无影响。正常小鼠中，nestin在神经系统外的组织也广泛表达。但nestin基因敲除小鼠其它器官并未发现明显异常。可见在nestin的体内功能十分复杂。
　　 目前，尚未有关于nestin过表达的转基因动物的研究报道。为研究nestin在体内的功能，我们建立了nestin转基因小鼠。本文探讨nestin过表达对小鼠咽喉部发育的影响。
　　 材料与方法：
　　 C57BL/6J小鼠来源的F5代的E14.5-19.5D的nestin转基因小鼠胚胎及F3代约12个月大小的nestin转基因小鼠，性别不拘。取部分小鼠新鲜组织，提取小鼠DNA后，PCR鉴定小鼠基因型。取材E14.5D、E15.5D、E16.5D、E17.5D、E18.5D、E19.5D、12M的小鼠咽喉部组织，将小鼠分为实验组与对照组，实验组为nestin阳性小鼠，对照组为野生型小鼠。每个年龄的小鼠各3只／组。
　　 将小鼠咽喉部连同周围的组织一同切下后，用Bouin氏固定液固定（组织脱水、染色等步骤见第一部分）。H.E染色后显微镜下观察比较两组样本的咽喉部形态学发育差异。同时，免疫组织化学法检测咽喉部nestin表达。免疫组织化学法采用SP法，组织使用鼠抗人nestin单克隆一抗抗体检测，4℃孵化过夜，抗体稀释度为1∶800。
　　 结果分析:采用SPSS13.0软件，实验组与对照组中咽喉部产生肿物的小鼠数量的比较采用卡方检验。若P＜0.05，认为二者差别有统计学意义。
　　 结果：
　　 Nestin在转基因小鼠胚胎咽喉部、气管咽粘膜大部分细胞、及其他器官中表达阳性。转基因小鼠咽喉部发育与正常小鼠相比，无明显不同。但约28％转基因小鼠咽喉部粘膜形成赘生物。实验组与对照组所得结果比较，其差别具有统计学意义(P=0.008)。
　　 结论：
　　 小鼠体内过表达nestin后，引起小鼠咽喉部肿物的发生。Nestin过表达可能导致小鼠咽喉部粘膜细胞的增殖与凋亡失调。

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