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无患子乙醇提取物抗非酒精性脂肪肝的实验研究

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摘要

前言

参考文献

第一章 无患子果皮的性状和显微鉴别及乙醇提取物制备

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 无患子乙醇提取物对小鼠的急性毒性实验研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三章 无患子乙醇提取物对大鼠非酒精性脂肪肝防治作用的实验研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第四章 全文讨论

本课题特色与创新之处

综述

附录

成果

致谢

声明

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摘要

研究背景
　　 肝脏是机体新陈代谢的重要器官，脂肪性肝病（Fatty liver disease）是指脂肪(主要是甘油三酯TG)在肝脏过度沉积的临床病理综合症，其病理表现为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化。肝有门静脉和肝动脉双重血供，但两者最终都是通过终末微静脉和微动脉与肝血窦相连，完成与肝细胞的物质交换后汇集于肝静脉，因此肝窦是完成肝脏物质交换的主要场所。而肝窦内皮细胞(Liver sinusoidal endothelial cell LSEC)与肝枯否(kupffer)细胞是主要的肝窦状隙细胞，且与肝内物质代谢及肝脏生理病理变化密切相关。LSEC受损，窗孔调节失控，如持续或过度扩张可使原不能通过的富含甘油三酯的乳糜微粒(CM)被肝细胞摄取造成脂质在肝细胞的堆积，引起急性脂肪肝。
　　 无患子（Sapindus mukorossi Gaertn）为无患子科无患子属的一种落叶大乔木，其果实又名肥皂树、洗手果或圆肥皂等，分布于我国长江流域以南地区及台湾省，日本、朝鲜、中南半岛和印度等地也常栽培。无患子味苦，性寒，有小毒;具有清热祛痰、消积杀虫之功效。近年来，随着对无患子研究的深入，其化学成分及其药理作用已逐渐被发现，引起人们越来越多的关注。
　　 无患子作为中药材在我国有悠久的使用历史。据考证，无患子始载于《本草拾遗》，《植物名实图考》亦有附图，关于其药用价值早在《本草纲目》中就有记载。现代药理基础研究发现，无患子具有多种生理活性和药用价值，主要包括抗肿瘤、降压、抗菌、抗炎等，有报道表明无患子皂苷对高脂血症大鼠血脂代谢有一定调节作用，但对无患子防治脂肪肝方面的研究尚未见报道。
　　 本研究的预实验结果表明，无患子粗提物对大鼠脂肪肝的形成具有一定的干预作用。在此基础上，本课题拟对无患子乙醇提取物的抗非酒精性脂肪肝作用进行深入研究。
　　 本研究拟通过大鼠体内实验检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶(ALP)、脂联素(APN)含量等指标的变化，以及运用扫描电镜和透射电镜技术观察正常和脂肪肝动物肝窦状隙细胞(LSEC)及kupffer细胞形态、数量及功能的变化，探讨分析肝窦状隙细胞(LSEC)的变化与相关酶类和细胞因子表达的改变在脂肪肝发病过程中的相关性，并给予中药无患子进行干预，进一步探寻脂肪肝的发病机制及药物作用靶点，为脂肪肝的防治提供新的思路与方法。
　　 研究目的：
　　 1、对无患子入药部位——无患子果皮进行性状和显微鉴定，认清无患子有效成分的物质结构基础，为下一步筛选该药活性成分（部位）提供理论依据。
　　 2、通过急性毒性实验，测定本课题所使用的无患子乙醇提取物对小鼠的半数致死量(LD50)，以保证实验用药过程的安全性和有效性。
　　 3、通过检测实验动物血清中转氨酶、脂蛋白等生化指标，以及观察实验动物肝脏细胞、LSEC窗孔、kupffer细胞等与脂肪肝相关的细胞因子的变化，初步探讨这些酶类、细胞因子与肝窦状隙细胞在脂肪肝发病过程中的相关性。
　　 4、采用药物无患子醇提物进行干预，验证其调节血脂、保肝护肝的疗效，为进一步探寻脂肪肝发病机制，寻找药物作用靶点提供参考资料。
　　 实验方法：
　　 1、制作药材显微制片
　　 ①永久制片:无患子干燥果皮，按常规石蜡切片，番红-固绿染色，中性树胶封片。
　　 ②粉末装片:无患子干燥果皮，65℃烘干1.5h，粉碎后，取粉末制作水装片和水合氯醛透化装片。
　　 2、药物提取液制备
　　 取无患子果皮，干燥粉碎后，第一次先用4倍量85％乙醇浸泡30min，90℃回流提取2h，收集提取液;第二次再用3倍量85％乙醇回流提取1.5h，两次提取液过滤后合并，浓缩至1g/ml，于4℃保存备用。
　　 3、急性毒性实验
　　 将KM小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分笼饲养，先适应性喂养1周。按小鼠急性毒性实验常规方法，给药前禁食不禁水12h，第1组至第6组分别按照500、1000、2000、3000、4000、5000mg/kg的剂量给药，每天灌胃2次（0.8mL/只），每次相隔12h，给药后观察小鼠是否出现耸毛、蜷卧、耳壳苍白或充血、突眼、步履蹒跚、肌肉瘫痪、呼吸困难、惊厥、昏迷、大小便失禁等毒性反应，连续给药观察14天。
　　 4、脂肪肝动物模型的建立及实验分组
　　 将体重220±20g的健康SD大鼠饲养在20±3℃自然光照环境下，取食饮水自由，雌雄各半，分笼饲养，正常饲养1周后开始造模，每周统一时间称量体重。实验分组:将48只实验SD大鼠随机分分为正常对照组、模型组、辛伐他汀阳性对照组(7.2 mg/kg)、无患子提取物高、中、低剂量治疗组(0.5、0.1、0.05g/kg)。除正常对照组投喂普通饲料，其他组均投喂高脂饲料连续6周，第4周开始同时对各药物组大鼠以相应药物进行灌胃（2mL/只），正常对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水;第42天17:00后禁食不禁水，第43天8:00处死实验大鼠采集血液和肝脏标本。
　　 5、血清中生化指标以及肝功能指标的检测
　　 第43天，把实验动物用10％水合氯醛(3mL/kg)麻醉后通过腹主动脉取血4～5mL，经3000r/min×15min离心，取上层血清，立即将大鼠血清样本送至南方医科大学中西医结合医院检验科检测AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C、γ-GT、ALP、APN含量，脂联素(APN)按试剂盒指示进行操作。
　　 6、病理切片、电镜样本的制备与观察
　　 ①病理切片:取出肝脏后，称湿质量，计算肝指数，并在肝右叶离边缘1cm处，横切一块肝组织（约3mm×3mm×10mm）用10％中性福尔马林固定，常规脱水，HE染色。
　　 ②扫描电镜:大鼠在体从肝门静脉插管，经0.9％生理盐水冲洗，灌注液滴注，待血液从下腔静脉切口流出至肝组织无血色停止灌注，取一块肝组织（部位、大小同上）浸泡于电镜用戊二醛中固定，4℃保存，再经逐级脱水，CO2临界点干燥，喷镀Pt，用扫描电镜观察肝组织结构及LSEC上窗孔的数目和大小。
　　 ③透射电镜:取出大鼠新鲜肝组织（部位同上、约1 mm3），浸泡于电镜用戊二醛中固定，4℃保存，经逐级脱水，用环氧树脂Epon812包埋剂37℃浸透并聚合包埋，修整后逐层切薄片，染色干燥后，用透射电镜观察肝细胞结构及其细胞器的数目和形态。
　　 7、统计方法
　　 实验结果数据均采用SPSS13.0软件进行统计分析，半数致死量(LD50)应用SPSS13.0软件中的Probit模块（概率单位回归）求出;计量资料采用One-WayANOVA方差分析，结果以平均数±标准差（X±s）表示，以P＜0.05为有统计学意义;等级资料采用K Independent Samples非参数检验，以P＜0.05为有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、无患子果皮显微鉴定
　　 ①外果皮为2～4层细小的类方形表皮细胞，外被较厚角质层，内含红棕色物质呈栅栏状排列;中果皮靠近表皮一侧具有6～10层厚角细胞，内含棕色物质，其内侧为薄壁细胞和大量溶生式分泌腔，可见众多草酸钙簇晶、方晶、石细胞夹杂其中，外韧型维管束稀疏分布，韧皮部外侧有木化的纤维束;内果皮细胞4～5层极扁平的木化细胞，紧密层叠。
　　 ②粉末棕色，极粘稠。外果皮细胞表面观呈不规则圆形，含棕色物质，直径20μm～25μm，细胞壁厚;草酸钙簇晶散在，直径12μm～35μm;内果皮细胞狭长，宽约10μm，以长轴方向在不同细胞层嵌列，可见方晶镶嵌其中;纤维多为成束的晶鞘纤维，直径10μm～15μm;可见螺纹导管、石细胞单个散在。
　　 2、急性毒性实验
　　 在2周给药时间内，第1组小鼠(500mg/kg)表现正常，无死亡记录;第2组小鼠(1000mg/kg)服药后，出现轻微脱毛，且活动能力稍有减弱，2周内死亡4只;第3组（2000mg/kg）与第4组小鼠(3000mg/kg)服药后出现不同程度的脱毛，生存小鼠精神萎靡，活动力差，经常眯眼，蜷卧嗜睡，食欲不振，灌胃时躁动不安，分别于第1周死亡4只和5只;第5组小鼠(4000mg/kg)出现较大面积脱毛现象，生存小鼠鼻腔周围抽搐或出血，呼吸急促，行动不协调，且大便量少，呈黑色黏稠状，第1周内死亡6只，尸体鼻腔有血迹;第6组小鼠(5000mg/kg)于3天内全部死亡，尸体皮肤发暗，口腔或鼻腔有血迹，剖开腹部发现其消化道肿胀，胃肠道内充满气泡状液体，其他内脏器官颜色发黑。
　　 3、各组体重和肝指数
　　 与正常对照组比较，模型组处死前体重显著降低，肝湿重以及肝指数显著升高(P＜0.05或P＜0.01)，说明脂肪肝造模成功;与模型组比较，各个给药组大鼠的肝湿重和肝指数均显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，说明药物对脂肪肝模型有一定防治作用。
　　 4、血脂生化检测结果
　　 与正常对照组比较，模型组血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT、γ-GT、ALP均显著升高(P＜0.01)， HDL-C、APN显著降低(P＜0.05或P＜0.01);与模型组比较，辛伐他汀组和无患子高剂量组(0.5g/kg)均能降低血清中TC、TG、LDL-C、AST、ALT并升高HDL-C和APN(P＜0.05或P＜0.01)，但对降低γ-GT和ALP，无患子各剂量组之间无统计学意义。
　　 5、光镜观察结果
　　 正常对照组肝小叶结构正常，肝索排列整齐，肝细胞大小均匀，多数肝细胞见一个细胞核，部分可见双核，肝窦清晰，汇管区无炎症细胞浸润;模型组多数肝小叶结构轮廓消失，肝细胞形态不规则，多数肿胀，内含大空泡状脂滴把核挤到一侧，甚者相间气球样变，肝窦不清晰，部分肝细胞出现点状或片状坏死，可见炎症细胞浸润;辛伐他汀组部分肝细胞肿胀、少数含小泡状脂滴;无患子高剂量组(0.5g/kg)肝细胞大小均匀，形态正常，少数肝细胞肿胀或含脂滴，肝窦清晰;无患子中剂量组（0.1g/kg）部分肝细胞肿胀并含脂滴，肝窦变窄;无患子低剂量组(0.05g/kg)部分肝细胞肿胀含脂滴，可见局灶性坏死。
　　 6、扫描电镜观察结果
　　 ①肝组织结构形态变化:正常对照组肝细胞索呈放射状整齐排列，肝窦结构清晰，胶原纤维数量及形态正常，贮脂细胞结构正常;模型组几乎所有肝细胞出现肿胀且大部分含脂滴，肝窦结构不明显，胶原纤维明显增生，贮脂细胞脂滴增多明显;辛伐他汀组肝细胞索排列规则，肝窦结构清晰，偶见含脂滴肝细胞;无患子高剂量组（0.5g/kg）肝细胞轻度肿胀，偶见含小泡脂滴的肝细胞，局部区域有少数胶原纤维增生;无患子中剂量组(0.1g/kg)肝细胞可见含脂滴肝细胞，胶原纤维稍有增生;无患子低剂量组(0.05g/kg)明显可见大部分肝细胞含大小不一的泡状脂滴，且胶原纤维明显增生。
　　 ②LSEC窗孔形态变化:正常对照组LSEC表面有一定数量的正常形态的窗孔(Φ0.05μm～0.2μm)以簇状排列呈筛孔状均匀分布;模型组LSEC表面的窗孔（Φ0.3μm～1.2μm）相互融合而失去筛孔结构，每个窗孔都显著扩张而使LSEC胞体趋于破裂欲脱落状，可见LSEC下方肿胀的肝细胞表面有微绒毛暴露;与正常对照组比较，辛伐他汀组窗孔(Φ0.05μm～0.2μm)数量、大小、形态与正常对照组接近;无患子高剂量组(Φ0.1μm～0.5μm)局部窗孔稍微扩张，但大部分形态仍保持正常;无患子中剂量组(Φ0.1μm～0.8μm)、无患子低剂量组(Φ0.2μm～1μm) LSEC窗孔分布杂乱，部分筛孔状结构互相连通成大窗孔，LSEC下方肝细胞表面的微绒毛暴露，但仍有小部分局域窗孔保持筛孔状。
　　 7、透射电镜观察结果
　　 正常对照组肝细胞形态结构正常，膜界限清晰，Disse隙正常，血窦面和胆小管面可见微绒毛伸入腔内，肝细胞连接面可见紧密连接、缝隙连接等，细胞质内可见数量丰富且形态正常的线粒体、内质网、高尔基体复合体、核糖体，以及糖原颗粒、微小脂滴等内含物，细胞核形状规则且居中，核仁明显;模型组肝细胞肿胀，胞浆中布满众多大小不一的脂滴空泡，Disse隙扩大且其中部分区域可见微绒毛和胶原纤维增生现象，偶见部分细胞中的内质网扩张，线粒体轻微肿胀;给药组与模型组比较，均可见肝细胞内脂滴空泡有不同程度的减少，各种细胞器以及细胞内含物都没有出现异常现象，其中，辛伐他汀组肝细胞内含少数脂滴;无患子高剂量（0.5g/kg）组肝细胞只含极少数脂滴，少数肝细胞有肿胀现象;无患子中(0.1g/kg)、低剂量组(0.05 g/kg)的肝细胞所含脂滴较多，部分细胞的Disse隙内微绒毛和胶原纤维有增生现象。
　　 结论：
　　 1、无患子果实中呈肉质部分为其果皮，而非假种皮;在外层棕色的外果皮和内层膜状的内果皮之间的细胞组织，为无患子的中果皮，存在于该部位的众多大型溶生式分泌腔即为无患了富含皂苷类物质的来源场所。
　　 2、无患子是一种具有两重性的药物，无患子皂苷具有疗效同时具有一定毒性。急性毒性实验结果显示，当无患子醇提取物剂量≥1000mg/kg时，实验动物（小鼠）在两周内开始出现不同程度中毒反应，甚至死亡，推测皂苷类成分导致肝毒性损伤机制与机体氧化应激诱导脂质过氧化、组织内巯基损耗而造成肝组织损伤有关。
　　 3、通过常规检测血清学指标和观察肝脏病理变化可以看出，与模型组比较，无患子提取物各剂量组大鼠的肝湿重和肝指数均显著降低(P＜0.05)，并能显著降低血清中TC、TG、LDL、AST、ALT的含量，恢复提高血中HDL、APN水平;在光镜下观察到肝组织病理变化明显有所改善，说明无患子乙醇提取物具有一定的调节血脂和防治脂肪肝的效果。
　　 4、通过扫描电镜和透射电镜观察进一步可见脂肪肝大鼠的LSEC受损而使窗孔过度扩张，验证造模成功;无患子提取物各治疗组在扫描电镜下观察到动物LSEC窗孔恢复趋于正常，透射电镜下观察到肝细胞形态亦恢复趋于正常，说明无患子乙醇提取物能起到一定的保肝护肝的作用，其中以高剂量(0.5g/kg)效果最佳。

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