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肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与硝普钠联合诱导胶质瘤细胞株U251凋亡的实验研究

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摘要

第一章 实验研究 TRAIL与SNP联合诱导胶质瘤细胞株U251凋亡的实验研究

1 前言

2 材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

第二章 文献综述 TRAIL在胶质瘤治疗中的研究应用

1 TRAIL及其受体

2 TRAIL的抗胶质瘤治疗作用

3 TRAIL在胶质瘤治疗中的研究应用

4 问题与展望

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

声明

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摘要

背景:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子家族新成员，在体内外实验中均表现出选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用，对正常组织无明显毒性，系统用药时肝脏副作用小，对于包括脑胶质瘤在内的各种恶性肿瘤治疗有良好的应用价值和前景。随着研究的深入，发现不同肿瘤对于TRAIL作用的反应性不一，约半数以上的肿瘤对TRAIL存在潜在的和获得性的耐药，限制了抗肿瘤治疗的临床应用。因此目前研究的重点在于寻找影响肿瘤细胞对TRAIL的反应因素及肿瘤细胞对TRAIL的耐药机制，从而提高TRAIL的抗肿瘤效应。已有研究证实，TRAIL与各种抗肿瘤药物、射线等其他因素联合应用能有效提高其抗肿瘤作用、克服肿瘤对TRAIL耐药性，同时发现许多药物是TRAIL凋亡诱导作用的增敏剂，如细胞毒性药物、小分子靶向药物、干扰素等。这些药物通过增强内源性和外源性凋亡信号、抑制抗凋亡因子、激活促凋亡因子等途径达到增强TRAIL对肿瘤细胞凋亡诱导作用目的。目前，发现新的、有效的TRAIL凋亡诱导增敏剂，并探索其增敏作用的相关机制是TRAIL的抗肿瘤作用研究中的重要方向。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种在生理和病理状态下细胞凋亡的调节因子，对正常细胞和肿瘤细胞均具有双向凋亡调节作用。生理水平或更低水平的NO可促进细胞抵抗某些凋亡诱导因素，而持续高浓度的NO可通过活化caspase蛋白酶家族，促进细胞释放细胞色素C(Cytochrome C，CytC)，上调p53基因，改变凋亡相关蛋白如Bcl-2表达，促进细胞凋亡。硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）是传统的NO供体药物，被广泛用于NO相关的细胞生物学研究，有研究表明SNP可诱导肿瘤细胞凋亡，其作用机制主要依赖于SNP释放的活性分子NO，NO可激活细胞内多种促凋亡分子，诱导细胞凋亡。本实验以人胶质瘤细胞株U251为实验模型，将SNP作为TRAIL诱导U251细胞凋亡的增敏剂，观察TRAIL与SNP联合作用对U251细胞的生长抑制的影响协同作用，研究不同浓度SNP对TRAIL诱导的肿瘤细胞凋亡作用，并通过检测与细胞凋亡相关的调控蛋白的表达初步探讨其可能的协同作用机制，以期为提高TRAIL体外抗肿瘤效应，克服肿瘤细胞对TRAIL耐药的进一步研究提供理论依据，从而为胶质瘤的治疗增添新的思路。
　　 方法:1细胞培养:胶质瘤细胞株U251在含10％胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)的DMEM/F12培养基中于37℃、5％C02培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。2 TRAIL、SNP及二者联合作用U251细胞形态学变化:以TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)单药及二者联合作用于U251细胞，于37℃、5％CO2条件下继续培养，于第12h、第24h用倒置相差显微镜观察细胞形态变化。3 MTT法测定U251细胞生长抑制率。3.1 TRAIL、SNP及二者联合作用对U251细胞的生长抑制率:取对数生长期的U251细胞，将TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)及二者联合作用于U251细胞24h，等量DMEM/F12培养基作为空白对照，采用MTT比色法测定OD值并计算各组U251细胞生长抑制率％=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100％。3.2不同浓度SNP对U251细胞的生长抑制率:取对数生长期的U251细胞，将不同浓度SNP(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mM)作用于U251细胞24h，等量DMEM/F12培养基作为空白对照，行MTT比色法测定测定每孔吸光度值（OD值），并计算细胞生长抑制率％=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100％。4 Griess法测定U251细胞内NO含量:取Griess法细胞NO检测试剂盒中的NaNO2标准品，用DMEM/F12细胞培养基稀释成不同浓度(0，1，2，5，10，20，40，60，100μM)，用Griess法检测标准品NO含量并绘制标准曲线。以0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mM不同浓度的SNP作用于U251细胞24h，用Griess法测定细胞内NO含量。5 AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测U251细胞凋亡率:取对数生长期的U251细胞，按分组予以不同处理因素:TRAIL组(800ng/ml)、SNP组(0.5mM)、联合作用组（TRAIL浓度为800ng/ml+SNP浓度为0.5mM）、空白对照组（等量DMEM/F12培养基）作用24h，进行流式细胞检测，用Cell Quest软件进行数据分析。认为Annexin V-FITC+PI+和Annexin V-FITC+PI-为凋亡细胞，每次计数10000个细胞，计算凋亡率。6 Western blot法测定U251细胞DR5、caspase-3、survivin、Bcl-2蛋白表达:取对数生长期细胞，以TRAIL(800ng/ml)、SNP(0.5mM)及二者联合作用24h，以等量DMEM/F12培养基为空白对照，westernblot法测定各组细胞DR5、caspase-3、survivin、Bcl-2、β-Actin表达，以β-Actin作为内参照，用AlphaEase FC软件分析，测定各组靶蛋白及内参照蛋白的灰度值，以同一样品中目的蛋白与内参灰度值的比值作为蛋白的相对含量。7统计分析:实验数据用SPSS19.0软件分析，结果用均数±标准差((x)±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
　　 结果:1倒置相差显微镜下U251细胞形态变化:对照组U251细胞呈不规则梭形，突触较多，折光度好，胞浆丰富，边缘清晰，与培养板黏合紧密。TRAIL作用12h、24h后，见部分细胞变圆、缩小，折光度降低，黏附性降低，并随着时间延长，变化细胞数量增多。TRAIL与SNP联合用药作用24h后，可见大量细胞变圆、缩小、脱壁，边缘毛糙，折光度降低，可见胞膜包裹的细胞碎片。2TRAIL、SNP与二者联合应用对胶质瘤细胞株U251的生长抑制作用:MTT法分别检测TRAIL、SNP与二者联合作用对U251细胞的生长抑制作用，结果显示TRAIL(800ng/ml)作用24h后U251细胞的生长抑制率为(59.272±3.197)％，显示出对U251细胞的显著生长抑制作用。SNP(0.5mM)作用24h后对U251细胞的生长抑制率为(35.467±3.091)％，对U251细胞同样有生长抑制作用，两者联合应用对U251细胞的生长抑制率为(77.425±1.702)％，较TRAIL单药作用组和SNP单药作用组显著提高(F=351.522，P=0.000)，组间存在显著性差异(P＜0.01)。3用Griess法测定不同浓度SNP作用后细胞内NO含量，①不同浓度(0.2 mM，0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0mM)的SNP作用U251细胞内NO含量分别为(0.708±0.070)％，(2.673±0.246)％，(4.587±0.770)％，(6.965±0.141)％，(10.931±0.827)％，随着SNP浓度的增高，细胞内NO含量递增。不同浓度(0.2 mM，0.5 mM，1.0 mM，1.5 mM，2.0mM)的SNP对U251细胞生长抑制率分别为(12.913±3.700)％，(35.993±2.808)％，(50.117±3.131)％，(61.141±2.355)％，(74.468±2.259)％。显示随着SNP浓度的增高，U251细胞生长抑制率逐步递增。②结合同浓度SNP对细胞生长的抑制作用，表明随着NO浓度增高，细胞生长抑制率升高，存在相关性(P＜0.01)。4TRAIL、SNP及二者联合诱导U251细胞凋亡:流式细胞术检测TRAIL、SNP及二者联用的细胞凋亡率，统计早期凋亡和晚期凋亡细胞所占比率，结果提示对照组凋亡率为(8.20±0.81)％，而SNP单药作用凋亡率为(26.88±4.19)％，TRAIL单药作用凋亡率为(36.87±3.69)％，均与对照组存在显著差异(P＜0.01);TRAIL与SNP联用时凋亡率上升至（67.55±3.45）％，联用组与较TRAIL、SNP单药组凋亡率显著提高，存在显著性差异(P＜0.01)。同时且TRAIL与SNP联用存在协同效应（协同因子=1.06），表明SNP可增强TRAIL对U251的凋亡作用。5 TRAIL、SNP及二者联合应用对U251细胞Bcl-2、caspase-3、survivin、DR5蛋白的表达:Western blot结果显示TRAIL作用24h后，与对照组相比，U251细胞内Bcl-2蛋白表达明显降低，caspase-3蛋白表达明量显增加，survivin表达显著升高，DR5表达量无明显变化;SNP作用24h后，与对照组相比，U251细胞内Bcl-2表达量明显降低，caspase-3表达量无明显变化，survivin表达量明显降低，DR5蛋白表达量明显增加;TRAIL与SNP联合作用24h后，与对照组相比，Bcl-2蛋白表达量明显降低，caspase-3表达量明显增加，survivin表达量明显降低，DR5表达量明显增加，均与对照组存在显著差异(P＜0.01)。表明TRAIL与SNP的协同效应与肿瘤细胞内上述四种蛋白的表达改变相关。
　　 结论:1TRAIL和SNP均可显著抑制体外培养的胶质瘤细胞株U251增殖，TRAIL与SNP联用可增强对U251细胞的抑制作用。2SNP对U251细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性，即随着浓度的增高抑制作用增强。3 SNP对U251细胞的抑制依赖于其释放的NO的生长抑制作用，并存在剂量依赖性，即随着细胞内NO浓度的增高细胞生长抑制率升高。4TRAIL和SNP均可诱导U251细胞凋亡，二者联合应用对诱导U251细胞凋亡具有协同作用，SNP对TRAIL诱导的凋亡存在显著增敏效应。5 TRAIL与SNP诱导细胞凋亡协同效应的机制与U251细胞内caspase-8蛋白表达上调、Bcl-2蛋白表达下调有关。SNP对TRAIL凋亡诱导效应的增敏机制与U251细胞DR5表达上调，Bcl-2和survivin表达下调有关。

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