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重组人CYP3A4大肠杆菌表达系统的建立

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摘要

第一章 前言

1．1 细胞色素P450

1．2 细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)

1．3 细胞色素酶P450的应用

1．4 药物代谢体外模型

1．5 本课题的研究目的和主要内容

第二章 人肝脏总RNA提取

2．1 材料、试剂和仪器

2．2 方法

2．3 结果及分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 CYP3A4基因克隆、修饰及鉴定

3．1 材料、试剂及仪器

3．2 方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

第四章 定点突变获得CYP3A4亚型*3，*15，*17，*18，*19

4．1 材料、试剂和仪器

4．2 方法

4．3 结果与分析

4．4 讨论

第五章 重组CYP3A4野生型的诱导表达及鉴定

5．1 材料、试剂和仪器

5．2 方法

5．3 结果与分析

5．4 讨论

第六章 总结

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

攻读硕士期间成果

致谢

声明

统计学证明

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摘要

细胞色素酶P450(CYP)是含有血红素的一族单加氧酶，主要参与代谢内源物质（如甾体、胆汁酸、脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、生物源性氨类等）和外源性物质的代谢。细胞色素酶能够催化生物界各种外源物质的氧化代谢，包括药物、植物提取成分或被真菌衍生的食物的次级代谢产物及大量的环境污染物、工业化合物、除草剂和除虫剂等。代谢外源物质的人源细胞色素酶P450的形式有CYP1，CYP2和CYP3家族。这些家族中的个别细胞色素酶P450具有很广泛的和重叠的底物特异性，负责约70-80％目前临床使用药物的代谢。
　　 人类细胞色素酶P450在代谢内源性物质和外源性物质包括药物中起重要的作用，因此，新的候选药在临床前开放阶段测试其与细胞色素酶间的相互作用是标准程序。
　　 药物和其他外源物质通过诱导或抑制对细胞色素酶活性调节，是药物相互作用的基础。药物的相互作用可以引起严重不良反应，这将导致药物开发的提前终止，拒绝批准上市，严重的处方限制，甚至于从市场上撤回药品。最常见的药物相互作用机制是对细胞色素酶的抑制。
　　 在药物开发前期，要常规开展实验来确定前体物质是由哪些细胞色素酶代谢的。此外，前体物质对细胞色素酶的抑制作用可用体外培养的方法来评估。通常，但并非总是，一种化合物能够抑制特定的细胞色素酶P450类型，同时也是这种细胞色素酶P450的底物。
　　 CYP3A4是人体内重要的细胞色素酶P450之一，占CYPs总量50％。CYP3A4在外源性物质代谢中具有举足轻重的作用，据估计有高达50％以上的临床使用的药物由CYP3A4代谢。CYP3A4能被多种药物诱导和抑制，且具有基因多态性，这是造成药物作用个体差异的最重要因素之一，也是发生药物相互作用的原因之一。CYP3A4的活性部位非常强大和其作用具有弹性，能允许结构非常不同的化合物结合与随后的代谢。
　　 大肠杆菌是用于表达人类细胞色素酶P450最常用的宿主。除了具有简单的遗传操作和培养外，大肠杆菌因其本身没有自己的细胞色素酶，成为表达人类细胞色素酶P450的合适宿主。同时，在大肠杆菌中蛋白的产量是非常高的，因此重组细胞色素酶P450在大肠杆菌中的表达水平是在酿酒酵母菌种表达水平的50-100倍。一般来说，人类细胞色素酶P450在大肠杆菌中表达的表达水平，可以从文献中发现，在一个显著的范围内变化。表达水平的不同可以归因于不同表达宿主的使用和遗传策略的实施。在大肠杆菌中表达人类细胞色素酶P450的表达水平关键取决于在培养这些大肠杆菌菌株时的培养条件。
　　 1991年，哺乳动物细胞色素酶P450蛋白通过对N-末端氨基酸序列的修饰第一次表达在大肠杆菌细胞中。自此后，为了使重组细胞色素酶P450在大肠杆菌中由功能的表达，各种不同的策略已经建立，包括N-末端序列的修饰，分子伴侣的使用和在低温度下培养。在所以情况下，在大肠杆菌中表达的人类细胞色素酶P450已被证明具有高效地催化氧化代表底物的能力。这些重组的细胞色素酶P450能够应用于研究，如估计药物的氧化反应动力学参数，也能用于鉴定人类细胞色素酶P450对药物的代谢途径和致癌物质的消除机制。现在可以使用各种不同种类的重组人类细胞色素酶用于各种目的，在制备一个新的候选药物的过程中，确定其代谢酶类已经成为了例行常规。这种方法已被用于体外制定合理的策略来预测相关的生物利用度，毒性和药物间相互作用。
　　 目的:
　　 比较生理盐水和RNAlater溶液两种处理保存组织方法对提取的总RNA的影响，以得到肝脏组织的比较好的保存方法。
　　 探讨α-ALA（0.5mM和1mM）、IPTG（0.5mM和1mM）、卡那霉素（50μg/mL和100μg/mL）添加浓度及菌的接种密度对重组CYP3A4膜蛋白表达水平的影响，以优化重组CYP3A4在大肠杆菌中表达条件。
　　 用含有T7启动子的表达载体pET-28a(+)，构建重人类CYP3A4大肠杆菌表达系统，以用于体外研究药物之间的相互作用，也可以用于新药开发时确定新药的代谢特征及与其他药物间的相互作用。在重组野生型CYP3A4基础上通过定点突变获得变异的CYP3A4，研究CYP3A4各亚型的药物代谢与野生型CYP3A4的差异来指导临床上个体化用药。
　　 方法:
　　 (1)人肝脏总RNA提取:收集的肝脏组织分别RNAlater溶液处理后保存-20℃下。按照TRIZOL(R)Reagent试剂说明书提取肝组织总RNA。测定总RNA的浓度和纯度，并用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)验证总RNA的完整性。
　　 (2)CYP3A4基因的克隆、修饰及鉴定:用逆转录扩增法(RT-PCR)，以总RNA为模板扩增目的基因CYP3A4。用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，割胶后，用凝胶回收试剂盒回收CYP3A4cDNA。将目的基因连接到pMD(R)20-T载体上，热激法转化到大肠杆菌E.coliDH5α中。经蓝白斑筛选并菌落PCR验证正确后，对目的基因进行N-末端MALLLAVF修饰和C-末端His(5)加尾修饰。连接到pMD(R)20-T（T载体）上，转化感受态E.coliDH5α，经蓝白斑筛选，菌落PCR验证后，送公司测序验证。测序验证结果正确的重组T载体（含有CYP3A4基因）经NcoI和XhoI双酶切后连接到经过同样酶切的pET-28a(+)上，转化都E.coliDH5α中，筛选、验证并提取质粒测序。
　　 (3)根据TakaraMutanBESTKit(D401)试剂盒定点突变原理，分别设计CYP3A4突变比较高的亚型CYP3A4*3、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19的5’端邻接（含有突变位点），3'端方向相反的引物以导入突变位点。同时根据参考文献上的引物合成上述五种亚型的突变引物。分别用TakaraMutanBESTKit(D401)试剂盒和重叠PCR两种方法对CYP3A4进行定点突变。突变后PCR产物经凝胶电泳后，割胶，用胶回收试剂盒回收目的片段，分别连接到表达载体或者自连，转化大肠杆菌后，经克隆筛选，菌落PCR验证后送公司测序。
　　 (4)将测序正确的重组表达载体pET-3A4转化到表达菌株E.coliBL21(DE3)中。通过SPSS13.0设计四因素二水平正交实验，对α-ALA(0.5mM和1mM)、IPTG(0.5mM和1mM)、卡那霉素（50μg/mL和100μg/mL）添加浓度及菌的接种密度（接种1％和接种2％）进行优化。并用SPSS13.0对结果进行分析，选择出比较好的组合进行下一步的大规模的诱导表达。
　　 诱导结束后，将菌液置于冰上冰冻10分钟，离心收集菌体。用TES（Tris-EDTA-sucrose）重悬菌体，并加入含溶菌酶的Tris缓冲液，冰上摇床孵育裂解细胞。离心后，收集球状体.沉淀用SRB缓冲液(spheroplasts-resuspendedbuffer)再悬浮，并在-80℃保存。保存的球状体在室温下解冻，然后加入1mMPMSF（phenylmethanesulfonylfluoride）和蛋白酶抑制剂。对悬浮液进行超声处理破碎处理后，离心，取上清液小心的转移到EP管中，再次高倍离心收集膜片段，膜片段用PB重悬，-80℃保存，备用。用BCA蛋白浓度定量分析测定膜蛋白的浓度。BSA蛋白浓度和OD578做回归分析。提取的膜蛋白经Westernblot验证是否是所需的目的蛋白。
　　 结果:
　　 (1)总RNA的浓度在300μg/gFW以上，纯度在OD260/OD280为1.96±0.015(纯净的RNA的OD260/OD280值为2.0)，经逆转录聚合酶链式反应验证发现总RNA的完整性比较，可以用于后续实验。
　　 (2)目的基因连接到T载体上经克隆筛选后，测序验证为CYP3A4基因。N-末端和C-末端修饰后，经测序验证修饰成功。连接到表载体上，克隆筛选后，测序验证为CYP3A4基因。
　　 (3)对CYP3A4进行定点突变后，获得CYP3A4*3，*15，*17，*18，*19亚型，经PCR验证正确，当测序结果显示仅有CYP3A4*19突变成功。
　　 (4)BSA蛋白浓度和OD578做回归分析，最终确定线性回归作为标准曲线(R2=0.999，P＜0.001)。用BCA蛋白浓度定量分析试剂盒测定的膜蛋白浓度在65μg/mL左右，α-ALA、抗生素（卡那霉素）、T7启动子诱导剂IPTG及接种密度高低两水平中对膜蛋白的表达水平的影响没有统计学意义(P值分别是0.973，0.270，0.346，0.194)。诱导表达后的膜蛋白经Westernblot验证为重组CYP3A4蛋白。
　　 结论:
　　 成功完成了对CYP3A4的表达载体构建，并获得了CYP3A4的一个亚型CYP3A4*19的克隆。在经过诱导条件的优化后，获得了CYP3A4的膜蛋白，膜蛋白经BCA法测定浓度显示表达量适中，并经Westernblot验证膜蛋白的特异性为重组的CYP3A4，为之后的重组CYP3A4蛋白酶活性的鉴定及药物相互作用应用鉴定了基础。
　　 本课题克服了以往表达重组细胞色素酶选用通用表达载体pCW的情况，应用含有T7启动自动表达载体pET-28a(+)来表达细胞色素酶CYP3A4。

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