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阿尔茨海默病的一级预防研究——白藜芦醇及花生根粗提物对星形胶质细胞的保护作用研究

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前言

第一章 白藜芦醇对B淀粉样蛋白诱导星形胶质细胞氧化损伤保护作用的初步研究

第一节 星形胶质细胞体外培养及损伤模型的建立

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

小结

参考文献

第二节 白藜芦醇对星形胶质细胞损伤的保护作用研究

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

小结

参考文献

第二章 花生根提取物对B淀粉样蛋白诱导星形胶质细胞氧化损伤保护作用的初步研究

第一节 无土栽培花生高产根系培养及粗提物制备

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

参考文献

第二节 花生根粗提物对星形胶质细胞氧化损伤保护作用的初步研究

1.材料和方法

2.结果

3.讨论

全文总结

研究特色与创新

缩略词表

成果

致谢

统计学证明

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摘要

研究背景和目的：
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是老年人群中常见的一种神经退行性变所致的痴呆疾患,主要表现为认知功能障碍。近年来,随着社会结构老龄化,老年痴呆引起了广泛的关注。根据美国阿尔茨海默病官方网站提供的数据显示,在美国和欧洲的痴呆患者中,50％～80％患者的痴呆类型为AD。阿尔茨海默病协会2008年公布的最新统计显示,美国每年由于AD以及其他类型痴呆直接或间接产生的医疗保健费用高达890亿美元。我国中国老年保健协会调研发现,在上海等发达城市,AD的发病率正以每年1.4％的速度上升。我国AD患者约占全球患者的四分之一,高达到600-700万人。因此,对于AD的预防与治疗是当前老年人群保健急需要解决的问题。对该疾病的预防不仅提高老龄人群的生存质量,促进人类健康；同时也可减轻由该疾病造成的医疗负担和经济负担,而对于稳定社会的基本单位--家庭也是至关重要的。
　　 AD主要病理特征为相对特异性的老年斑(senile plaques,SP)生成、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NTFs)和神经元的丢失。研究表明,氧化应激与AD病理过程密切相关。氧自由基是机体正常或异常代谢过程如β淀粉样蛋白聚集等现象所产生,生成的氧自由基可攻击蛋白质、核酸和生物膜,导致线粒体损伤和钙超载等现象,造成神经细胞损伤。近年来,大量的研究结果已将氧化应激引起的神经退行性病变和细胞凋亡置于AD研究的中心位置。
　　 B淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)是老年斑的主要成分,其沉积可诱导胶质细胞通过不同的途径产生活性氧和氧自由基,引起细胞氧化损伤。而星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种细胞,其数量大约为神经元的十倍。由于其呈网络分布,并广泛参与神经系统的突触信号传递和处理,所以当其对神经元的保护作用失代偿后,整个中枢神经系统的损伤将出现瀑布效应,最终导致神经元的损害、认知功能障碍以及AD患者的多种行为与心理症状。因此,寻找一种具有抗氧化活性和抗自由基损伤作用,同时毒副作用又较小的有效物质,已经成为AD一级预防的一个重要切入点,也是开发抗AD新药的重要途径。天然的植物提取物目前被认为是最佳的寻找途径。其中,白藜芦醇具备了抗氧化等特性,同时也是天然的植物提取物之一。因此,本文从无土花生根中提取的白藜芦醇粗品,研究其对星形胶质细胞的保护作用。
　　 白藜芦醇(Resveratrol,Res),是来源于植物中的天然多酚类物质,广泛存在于虎杖、花生、葡萄等植物中,其化学名3,5,4’-三羟基反式芪(3,5,4’-trihydroxystilbene),一般为反式白藜芦醇,它常与顺式异构体及白藜芦醇甙(resveratrol glucoside)共同存在。其体内的作用主要包括抗细胞膜脂质过氧化、清除氧自由基、类雌激素等。在神经保护作用方面,目前研究表明白藜芦醇能有效的对抗中枢神经缺血损伤,保护缺血区神经元,减少梗死范围,降低缺血再灌注所造成的迟发性神经细胞的凋亡,改善脑缺血引起的肢体运动功能障碍。白藜芦醇对神经系统的保护作用已有较多研究,但目前的研究主要集中在神经元上,对于星形胶质细胞的影响少见报道。
　　 结果
　　 一、星形胶质细胞AD细胞实验模型的建立
　　 运用震摇方法对乳鼠大脑皮质星形胶质细胞进行纯化,通过GFAP免疫组化染色鉴定,培养的星形胶质细胞纯度>95％。采用不同浓度Aβ对细胞进行损伤后,细胞处理同一时长,随着Aβ浓度增加细胞存活率逐渐下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；在同一Aβ浓度水平时,细胞的存活率则随着损伤时间的延长而下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中25 μmol/L Aβ处理24h实验组、50 μmol/L Aβ处理12h实验组,细胞存活率最接近50％,有利于后续试验中观察白藜芦醇是否具有保护作用,亦或是加剧损伤等；根据吖啶橙荧光染色分析细胞形态后发现,25μmol/L Aβ处理24h实验组细胞形态优于50 μmol/LAβ处理12h实验组,及前者存活的细胞其细胞形态及细胞膜状态优于后者。因此,本次实验选用25μmol/L Aβ处理24h作为细胞损伤的条件。
　　 二、白藜芦醇对星形胶质细胞的保护作用
　　 (1)细胞存活率:Aβ损伤星形胶质细胞后,细胞存活率急剧下降至51.84％,三组不同浓度(1、10、100μmol)的白藜芦醇预处理细胞后,细胞存活率分别为54.23％、75.12％、85.98％,呈浓度剂量关系递增。但1 μmol的白藜芦醇对细胞保护作用无统计学意义；
　　 (2)LDH漏出量:收集上清液检测LDH漏出,结果显示,10、100 μmol的白藜芦醇较Aβ损伤组相比较,可减轻LDH的漏出,但1μmol的白藜芦醇或加剧LDH漏出。提示10、100 μmol白藜芦醇对细胞损伤具有保护作用。
　　 (3)ROS水平检测:荧光检测显示,蛋白损伤使得荧光强度增高(P<0.05),1 μmol/L RES处理组荧光强度大于Aβ处理组,其余两组荧光强度均小于Aβ处理组(P<0.05)。结果表明10、100μmol/L RES可降低细胞损伤后胞内ROS水平,而1 μmol/L RES则提高了胞内ROS水平,提示10、100μmol/L RES对AS工具有保护作用。
　　 (4)SOD、GSH-Px活性:裂解细胞,测定蛋白浓度后,对胞内SOD、GSH-Px抗氧化酶活性检测结果显示:Aβ损伤使得胞内SOD及GSH-Px抗氧化酶活性降低,10、100 μmol白藜芦醇处理组SOD活性较Aβ处理组有显著提高,而1 μmol白藜芦醇处理组SOD活性无统计学意义(P>0.05)。1、10、100 μmol白藜芦醇处理组GSH-Px活力较Aβ处理组有不同程度的增加,呈浓度依赖关系递增,差异具有统计学意义(P<0.05)。由于1μmol白藜芦醇处理组SOD与GSH-Px活性结果不一致,所以尚不能说明其对细胞是否具有保护作用。
　　 (5)丙二醛(MDA)浓度测定:不同浓度白藜芦醇(1、10、100μmol)预处理星形胶质细胞细胞后,采用25 μmol/L Aβ对细胞进行24h损伤,之后进行MDA检测。检测结果显示:Aβ处理组处理组MDA浓度显著高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)；各白藜芦醇浓度剂量保护组MDA浓度低于Aβ处理组,且随着白藜芦醇浓度的升高,MDA浓度呈现下降,各组间差异具有统计学意义。
　　 三、无土栽培高产花生根系诱导白藜芦醇
　　 利用生物诱导子等活性成分,对高产花生根系进行诱导。薄层色谱法鉴定诱导前白藜芦醇呈阴性、诱导后白藜芦醇显示阳性；高效液相色谱法(HPLC)定量结果,白藜芦醇含量为480.975 μg/g DW,而野生花生根白藜芦醇含量为51.23μg/g DW,转基因番茄和转基因莴苣白藜芦醇含量分别为53μg/g DW、56.40μg/g DW。
　　 四、花生根粗提物对星形胶质细胞的保护作用
　　 (1)粗提物无毒浓度筛选:cck-8法测定细胞存活率结果显示:与正常对照组相比,粗提物浓度在10-2g/L及其更低浓度之后,细胞存活率没有显著性差异(P<0.05)。因此,本实验最终选取10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L三个浓度粗体进行后续的细胞保护作用研究。
　　 (2)LDH漏出量:不同浓度粗提物(10-2g/L、10-3g/L、10-4g/L)预处理细胞,采用Aβ损伤细胞,之后检测LDH含量。结果显示:Aβ损伤可导致细胞LDH漏出量增加(P<0.05),三组浓度粗提物LDH漏出量均较Aβ组有所减少(P<0.05),且浓度越高,LDH漏出量越少,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。提示粗提物对细胞膜完整性起到了一定的保护作用。
　　 (3)SOD、GSH-Px:SOD活性检测结果显示:与正常对照组相比,Aβ处理组SOD活性显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；10-2g/L、10-3g/L粗提物浓度组SOD活性较Aβ处理组增高(P<0.05),10-4g/L浓度组与Aβ处理组差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 GSH-Px检测结果显示:Aβ处理组GSH-Px活性较正常对照组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；10-2g/L、10-3g/L粗提物浓度组GSH-Px活性较Aβ处理组增高(P<0.05),10-4g/L浓度组与Aβ处理组、10-3g/L与10-4g/L浓度粗提物组,组间差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 提示10-2g/L、10-3g/L浓度的粗提物对星形胶质细胞的氧化损伤具有保护作用。
　　 结论
　　 1、成功建立了星形胶质细胞AD细胞模型；
　　 2、10、100 μmol/L启藜芦醇对Aβ所致的细胞损伤具有保护作用；
　　 3、成功利用实验室无土培养的花生高产根系培养方案培养出高产根系,并诱导白藜芦醇含量达480.975 μg/g DW；
　　 4、10-2g/L、10-3g/L浓度的粗提物对Aβ所致的星形胶质细胞的氧化损伤具有保护作用。

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