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Reg Ⅳ在炎症性肠病的表达及其对病变活动度的预测作用

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摘要

背景和目的：
　　 炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组病因未明的非特异性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)。近二十余年来,随着人们生活方式的变化和诊断水平的提高,国内炎症性肠病的发病率有逐年上升的趋势。疾病是处于活动期还是静止期直接关系到疾病的正确治疗。IBD临床表现复杂多变,诊断缺乏特异性的指标,而且常因对病情活动的判断不准确而延误治疗。目前临床评价 IBD 活动与否主要通过临床症状、实验室生化指标、内镜下的表现及病理等综合判断。其中 C-反应蛋白(CRP)几乎全部由肝脏产生,短时间内(数小时)即可升高,而机体一旦恢复,CRP 又迅速恢复正常(6～7d)。CRP 可及时而敏感地反映炎症活动,是目前临床最为推崇的IBD活动性指标之一。另外,各国专家针对IBD制定出疾病活动指数(disease activity index),对疾病的活动性进行量化处理,从而更客观准确地反映疾病的活动性,帮助临床医师作出正确的医疗决策。评价 UC 活动度常采用Southerland 疾病活动指数,也称 Mayo 指数,较为简单实用,包括腹泻、便血、粘膜表现、医师评估病情几个评价指标。Best的CDAI 计算法是国际上广泛应用于临床和科研的评价 CD 活动度的指标。根据腹痛、腹泻、腹块等8个变量,通过 1 周观察计分,乘以规定的权重,求得各自分值,再计算积分。但少数患者尤其是某些早期和复发患者,血生化表现不显著,而且在疾病活动的早期内镜也不能发现。有必要寻找新指标以更全面、准确地评价 IBD的炎症活动度,为临床应用奠定理论基础。
　　 再生基因(regenerating gene,Reg)家族属钙依赖的植物血凝素超家族,主要在肝、胰和胃肠道发挥作用,是一组分泌性蛋白,与糖尿病、组织损伤、炎症、肿瘤尤其是消化道肿瘤密切相关。根据Reg基因编码蛋白的一级结构,Reg家族可分为四个亚型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。Reg Ⅳ 最早由 Hartupee 于2001首次从炎症性肠病病人中分离。Reg Ⅳ 在正常人的胃肠道即有低表达,包括结肠、小肠、胃和胰腺。另外在结肠、胆囊、前列腺及胃等肿瘤组织中均可发现 Reg Ⅳ表达显著升高。目前关于 Reg Ⅳ的研究多集中其与胃肠道肿瘤的关系,研究表明RegⅣ起到了促增殖和抗凋亡的作用,但是在IBD中的具体表达及其在炎症性肠病中的机制尚不清楚；炎症性肠病中 Reg Ⅳ与炎症指标如 C 反应蛋白及疾病活动度的关系仍有待研究。因此我们运用免疫组化分析Reg Ⅳ 在UC、CD 及正常人肠粘膜上皮细胞中的表达情况。并进一步研究了RegⅣ表达与CRP、CDAI、Mayo指数的关系；以明确Reg Ⅳ是否可作为评价IBD活动度的新的指标。
　　 方法
　　 1 临床取材 收集了 2008 年1月-2010年1月在我院消化内科门诊和住院的IBD患者病变部位肠粘膜活检标本61例,其中CD23例,UC38 例。同时还另外收集了25例健康体检者的肠粘膜标本。所有检查对象在征求同意后,行结肠镜或双气囊小肠镜检查并取活检,所有IBD患者的病例资料至少由两位消化专科医师重新复习病史和资料,统一按照中华医学会消化病学分会炎症性肠病学科组制定的诊断指南进行诊断,并经组织病理学活检得到确诊。健康体检者的肠粘膜标本取自排除显著器质性病变且肠镜下诊断为正常肠道的健康体检者。同时采集了所有研究对象的血常规及生化指标。IBD的活动度主要参考 CDAI(Crohn's disease activity index)和Mayo 指数(也称作 Southerland DAI)。
　　 2 免疫组织化学:采用免疫组化方法检测 RegⅣ在IBD组及健康体检组中的蛋白表达情况。由两名病理科医师在不知道临床资料的情况下独立判定免疫组化染色的结果。染色结果综合染色强度及阳性细胞百分数两个方面进行半定量分析。
　　 3 病情分期 溃疡性结肠炎及克罗恩病均根据临床资料分为活动期和缓解期。评价 UC 活动度采用 Mayo 指数,也称作Southerland 疾病活动指数,较为简单实用,包括腹泻、便血、粘膜表现、医师评估病情几个评价指标,求得每例患者的分值。评价 CD的活动度采用 Best的CDAI计算法[1]。根据腹痛、腹泻、腹块等8个变量,通过1周观察计分,乘以规定的权重,求得各自分值,再计算积分。
　　 4 病理学诊断 所有活检标本均送南方医院病理科进行处理由两名资深病理医生进行分析。病理论断标准主要参考中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组于2007年制定的我国炎症性肠病诊断规范的共识意见。
　　 5 RT-PCR 检测 RegⅣ mRNA 水平 采用逆转录.聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测 IBD 患者及健康体检者中的mRNA 表达情况。
　　 6 统计学分析 结果以平均值±标准差(X±s)表示,RegⅣ表达情况在IBD及健康对照者之间的比较、RegⅣ表达情况在UC及CD中的比较、Reg Ⅳ表达情况在活动期及缓解期 UC 中的比较,Reg Ⅳ表达情况在UC及健康对照者中的比较、Reg Ⅳ表达情况在活动期CD及缓解期CD中的比较均采用 Mann-WhitneyU 法。多组之间比较采用 One-Way ANOVA 检验。CRP 与 CDAI、Mayo 指数相关性采用 Pearson 相关分析。所有的统计结果以 P<0.05 作为有统计学意义；参数比较前均进行正态性检验和方差齐性检验,在符合正态分布和方差齐性的基础上进行比较。
　　 结果
　　 1.RegⅣ 在IBD病人及健康人中的表达情况
　　 我们通过免疫组化检查观察炎症性肠病病人及健康查体者肠粘膜中 Reg Ⅳ表达情况。免疫组化结果显示RegⅣ 蛋白主要着色于肠粘膜上皮细胞的胞浆。在健康查体者中 Reg Ⅳ的表达情况是:未表达(0 例),弱表达(19 例,76％),中度表达(4 例,16％),强表达(2例,8％)。在IBD 患者中,未表达(0 例),弱表达(17 例,27.9％),中度表达(17例,27.9％),强表达(27 例,44.2％)。
　　 Reg Ⅳ 在炎症性肠病病人肠粘膜中的表达较健康查体者显著增加(P<0.05)。CD 与 UC 病人Reg Ⅳ的表达没有显著差异(P=0.503)。通过比较活动期 UC 病人较非活动期 UC,我们发现前者肠粘膜 Reg Ⅳ表达显著增加(P<0.05)。而非活动期 UC 病人与健康查体者之间Reg Ⅳ的表达没有显著差异(P=0.406)。CD 无论活动与否,其Reg Ⅳ的表达量差异不大(P=0.515)。
　　 RT-PCR 结果提示活动期 UC 中 RegⅣ 在mRNA水平明显高于缓解期及健康人,而活动期与缓解期 CD 中 RegⅣ在mRNA水平均高于健康人。RT-PCR与免疫组化具有较好的一致性。
　　 2.Reg Ⅳ表达与IBD病人活动程度及 C 反应蛋白之间的关系
　　 接下来我们研究了 Reg Ⅳ表达水平与血清CRP浓度之间的关系。在UC病人中,血清CRP浓度随着 Reg Ⅳ表达的增强而升高(P<0.05):Reg Ⅳ 在弱表达的病人 CRP 为5.59±4.59mg/l,中度表达时 CRP 为13.73±10.86mg/l,而强表达时,CRP 为88.33±47.99mg/l。而在 CD 病人中,不同Reg Ⅳ表达水平病人所对应的CRP 浓度并无显著差异(P=0.455),分别为弱表达:18.844±20.60 mg/l),中度表达:43.66±34.24mg/l,强表达 41.90±41.48mg/l。
　　 同时,我们研究了 Reg Ⅳ 与炎症性肠病活动度之间的关系。我们发现在RegⅣ 不同染色强度中 Mayo 指数分别为:弱表达4.58±1.88,中度表达 6.20±1.32,强表达 8.06±2.38。可见,在 UC 患者中,Mayo指数随着Reg Ⅳ表达的增强而升高。(P<0.05)。在CD病人中,Reg Ⅳ不同染色强度中 CDAI 指数分别为:弱表达 148.40±38.12,中度表达179.14±64.87,强表达241.36±136.95,可见,不同 Reg Ⅳ表达水平所对应的CDAI 指数并无显著差异(P=0.226)。CRP 浓度与UC及CD的炎症活动度指数均呈正相关:Mayo指数(r=0.627.,P<0.05),CDAI(r=0.624,P<0.05)。
　　 结论
　　 1、在正常人中,已有低水平的RegⅣ表达,而IBD可伴有Reg Ⅳ表达水平的显著增加。活动期UC较缓解期的UCReg Ⅳ的表达增强；而CD无论活动与否,其RegⅣ的表达量差异不大。
　　 2、在UC病人中,血清CRP浓度、Mayo指数随着RegⅣ表达的增强而升高；而在CD病人中,不同RegⅣ表达水平病人所对应的血清CRP浓度及CDAI指数并无显著差异,这表明RegⅣ与CRP、Mayo指数一样可作为评价UC活动度的指标。
　　 3、肠粘膜活检标本中Reg Ⅳ的免疫组化染色有可能成为一种评价UC活动度的新指标,补充常规内镜病理活检的不足,但尚需大样本研究以进一步证实。

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