分子伴侣辅因子CHIP与帕金森病PINK1基因的相互作用研究

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帕金森病是最常见的神经退行性疾病之一，随着社会人口的自然老化，患病人数逐年增多，对中老年人的身体健康和生活质量造成严重危害，而目前本病尚缺乏长期有效的治疗手段。因此，研究帕金森病的病因和发病机制，对于早期诊断和治疗手段的开发均具有重要意义。大部分病例为散发性的，仅有约10％PD患者有家族史。近年来随着分子遗传学研究的进展，在一些单基因遗传方式的家族性PD患者中，已经成功定位并克隆了多个致病基因。新近发现的PINK1基因不仅是家族性遗传性PD的致病基因，在散发性PD患者的发病中亦起着重要作用。我们在前期工作中已经发现PINK1蛋白是通过UPP通路降解。但介导PINK1蛋白降解的E3泛素-蛋白连接酶并不清楚。目的:我们的前期研究发现PINK1蛋白可以通过UPP降解，但是相应的E3泛素-蛋白连接酶并不清楚；而CHIP是一个E3泛素-蛋白连接酶，可以介导许多神经退行性疾病相关蛋白质的降解。因此，我们推测CHIP与PINK1之间很可能存在相互作用，CHIP很可能通过其E3泛素．蛋白连接酶活性促进PINK1蛋白的降解。在本研究中，我们拟采用载体构建、Western blotting、RT-PCR、免疫共沉淀、免疫双标共定位等技术鉴定CHIP与PINK1的相互作用，有望进一步明确PINK1基因的功能及其在帕金森病发病中的分子作用机制。方法:（1）构建CHIP真核表达载体并检测其在COS-7细胞中表达 ①用PCR方法从人cDNA文库DNA中扩增CHIP全长cDNA，该基因片段两端设计了HindⅢ和BamHⅠ限制性酶切位点。 ②pcDNA3．1（+）/CHIP的构建及酶切鉴定，分别将PCR产物和pcDNA3．1（+）质粒用同样的酶进行双酶切，酶切条件为37℃1h，内切酶为BamHⅠ和HamⅢ。酶切产物一部分经过琼脂糖电泳检测后，剩余产物纯化，以便于后面的目的DNA与质粒的连接。 ③连接，目的DNA片段和线性化pcDNA3．1（+），按摩尔浓度比3：1的比例混匀，在T4DNA连接酶作用下22℃连接5min。连接产物转化感受态DH5α菌，接种于含Amp的LB琼脂平皿上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落，小量制备质粒，以DNAStar SepMan软件进行酶谱分析后，用HindⅢ、BamHⅠ双酶切质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，并送TAKARA公司测序。 ④peDNA3．1（+）/CHIP的表达鉴定我们采用RT-PCR和Western免疫印迹法。具体方法是用pcDNA3．1（+）/CHIP转染COS-7细胞后提取RNA及蛋白，分别行RT-PCR及Western免疫印迹法。 ①在COS-7细胞密度达到70％-80％时，用脂质体共转染pcDNA3．1（+）/CHIP及pcDNA3．1-myc-his-（-）B/PINK1，转染6h后换液。转染48h后分别提蛋白进行免疫共沉淀实验及免疫荧光实验。 ②提取细胞蛋白后每管总蛋白中加入20μlProteinA琼脂糖珠（50％），4℃摇晃15min，4℃，12000g离心1min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子。加入1～2μl的兔抗到500μl总蛋白中，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜。加入15～30μlProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物2h。12000rpm瞬时离心30s，去上清，用预冷的PBS洗3遍，1000μl/遍，用20μl4×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀。将上样样品煮5min，12000rpm瞬时离心30s，将上清电泳。 ③COS-7细胞，用PBS洗净后，甲醇-20℃固定10分钟，然后1×PBS洗3次，每次5分钟。0．5％Triton X-100透化20分钟，1×PBS洗3次，每次5分钟。5％BSA室温封闭20分钟。加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜或室温度2小时，1×PBS洗3次，每次5分钟。加荧光二抗（用1％BSA稀释）60分钟，1×PBS洗3次，每次5分钟。抗荧光衰减剂封片后在荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。结果:（1）成功构建了CHIP真核表达载体并在COS-7细胞中表达 ①以人cDNA文库为模板的PCR反应中可以扩增出大小相当于900bp的特异性片段，这与GenBank中发布的人CHIP序列的编码部分长度相同。pcDNA3．1（+）/CHIP重组体用HindⅢ、BamHⅠ双酶切后，可切出4．7Kb和900bp两个片段，表明CHIP和pcDNA3．1（+）连接成功。测序所得序列与GenBank中发布的序列用DNAStar SepMan软件进行比较，结果完全相同。 ②转染后48h的COS-7细胞检测到CHIPmRNA表达明显升高，而同期未转染的COS-7细胞中CHIP的表达较低。 ③COS-7细胞总蛋白中CHIP用Western-blotting检测显示，未转染细胞的CHIP很少，而转染48h的COS-7细胞中CHIP明显增高。（2）成功验证了PINK1在细胞内（in vivo）与CHIP的相互作用。 ①COS-7细胞经pcDNA3．1（+）/CHIP及pcDNA3．1-myc-his-（-）B/PINK1共转染后细胞产物分别用蛋白质印迹法分析，结果表明CHIP及PINK1在COS-7细胞内能稳定和高效地表达。 ②在COS-7细胞内共转染了pcDNh3．1（+）/CHIP及pcDNA3．1-myc-his-（-）B/PINK1后，其抗CHIP免疫沉淀产物中有PINK1的存在，说明CHIP蛋白在细胞内能与PINK1蛋白相互结合，并和PINK1一起在免疫沉淀时被分离出来。 ③激光共聚焦显微镜下观察CHIP和PINK1蛋白的亚细胞定位。结果发现应用MG-132诱导后PINK1蛋白形成了蛋白聚集物，CHIP与PINK1蛋白聚集物共定位。讨论帕金森病的病因和发病机制并不十分清楚。流行病学研究显示，约10％的帕金森病患者有家族史。呈单基因遗传方式的家族性帕金森病主要包括常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传两种类型。常染色体显性遗传性帕金森病目前有4个致病基因已经被克隆，分别是α-突触核蛋白基因、UCH-L1基因、NR4A2基因和LRRK2基因；常染色体隐性遗传性帕金森病目前有3个致病基因已经被克隆，分别是parkin基因、DJ-1基因和PINK-1基因。本研究选取帕金森病新近克隆的一个致病基因-PINK1基因，我们的前期工作发现PINK1蛋白通过泛素-蛋白酶体通路降解。但介导PINK1蛋白降解的E3泛素-蛋白连接酶并不清楚。在此工作基础上，我们拟进一步研究分子伴侣辅因子CHIP对PINK1降解过程的调节作用，深入阐释PINK1基因的功能及其在帕金森病发病中的分子作用机制，为帕金森病的基因治疗研究提供理论依据。泛素-蛋白酶体通路是胞质和胞核内ATP依赖性的蛋白质非溶酶体降解机制，它高效、高选择性的降解细胞内蛋白质，发挥重要的蛋白质质量控制作用，如祛除突变和错误折叠的蛋白，翻译后受损伤的蛋白；此外，在环境和/或细胞应激条件下，一些蛋白受到损害时，这些受损害的蛋白也是通过UPP降解。迄今为止所发现的帕金森病疾病基因表达产物中，parkin蛋白、α-突触核蛋白和synphilin-1均通过UPP降解。而UPP功能障碍与许多神经退行性疾病有关，特别是家族性和散发性（特发性）帕金森病。特发性帕金森病存在该通路功能障碍。而UPP功能障碍与某些家族性帕金森病直接相关。帕金森病的两个致病基因：parkin基因和UCH-L1基因所编码的蛋白质均在UPP通路中发挥作用。在UPP中，底物蛋白的泛素化与降解需要一系列酶促反应：首先，泛素激活酶水解ATP，泛素与E1之间形成高能硫酯键而激活泛素；然后，激活的泛素被转移到泛素结合酶的巯基上。在选择性泛素-蛋白连接酶催化下，泛素的羧基端甘氨酸残基与底物蛋白的赖氨酸ε-氨基基团之间形成共价结合而使底物蛋白泛素化；这种泛素化过程反复进行，形成多聚泛素链；多聚泛素化的底物蛋白再被提呈给26S蛋白酶复合体，该复合体选择性降解多聚泛素化的蛋白质；在该降解过程中，多聚泛素化的蛋白质在泛素羧基末端水解酶作用下释放出泛素。泛素-蛋白连接的选择性主要决定于特异性的E3酶。分子伴侣辅因子CHIP是泛素-蛋白酶体通路的一个重要成分，与许多神经退行性疾病有关，并促进这些蛋白质的降解。我们的前期研究发现PINK1蛋白可以通过UPP降解，但是相应的E3泛素-蛋白连接酶并不清楚；而CHIP是一个E3泛素-蛋白连接酶，可以介导许多许多神经退行性疾病相关蛋白质的降解。因此，我们推测CHIP与PINK1之间很可能存在相互作用，CHIP通过其E3泛素-蛋白连接酶活性可以促进PINK1蛋白的降解。在本研究中，我们以人cDNA文库DNA为模板扩增获得了人CHIP的全长cDNA，通过基因重组技术成功构建了pcDNA3．1（+）/CHIP真核表达载体。转染48h后的COS-7细胞可见CHIP的高表达，提示CHIP基因的真核表达载体的成功构建，且在COS-7细胞中能表达目的蛋白。采用免疫共沉淀、免疫双标共定位等技术鉴定CHIP与PINK1的相互作用，这证明CHIP很可能是介导PINK1蛋白通过UPP途径降解的E3泛素-蛋白连接酶，有望进一步明确PINK1基因的功能及其在帕金森病发病中的分子作用机制。

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作者
刘越存;
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作者单位

南方医科大学;

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授予单位南方医科大学;
学科神经病学
授予学位硕士
导师姓名王丽娟;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类震颤麻痹综合征;
关键词
帕金森病; 分子伴侣; PINK1基因; 泛素化; 蛋白相互作用;

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