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神经细胞黏附分子的多聚唾液酸调控皮层氯化钾损伤及所诱发的室管膜下区神经细胞增生和迁移研究

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第1章 前言

1.1 神经细胞粘附分子

1.1.1神经细胞黏附分子的概述

1.1.2 NCAM的多聚唾液酸化

1.2 PSA-NCAM在成年大鼠神经系统中的分布和作用

1.2.1 PSA-NCAM在成年大鼠皮层区域的表达

1.2.2海马内PSA-NCAM的表达与空间学习记忆的关系

1.2.3 PSA-NCAM在室管膜下区域(SVZ)的表达以及与神经前体细胞迁移的关系

1.3皮层传播性抑制

1.4 本论文的目的与意义

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验耗材与试剂

2.1.4 实验中主要缓冲液和培养基

2.2 实验方法

2.2.1 Endo-N的提取

2.2.2 常规免疫组化

2.2.3 BrdU的免疫组化

2.2.4. Morris’s 水迷宫

2.2.5 皮层扩散性抑制的诱发和记录

2.2. 6腺病毒相关病毒AAV的包装

2.2.7 Real-time PCR检测表达水平

2.2.8 数据统计及分析

第3章 结果与讨论

3.1 实验结果

3.1.1 Real Time PCR检测皮层PSA转移酶表达水平

3.1.2 免疫组织化学检测大鼠皮层PSA-NCAM的蛋白表达水平

3.1.3 PSA对皮层传播性抑制场电位的变化幅度和持续时间的影响

3.1.4 去除PSA之后对大鼠记忆的影响

3.1.5 Endo-N 对氯化钾诱导下的SVZ和皮层区域的新增细胞迁移影响

3.1.6 SVZ定位注射AAV感染示踪SVZ的神经前体细胞

3.2 讨论

第4章 结论

参考文献

致谢

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摘要

多聚唾液酸化的神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)对中枢神经系统的生长发育过程有重要的作用,如调节轴突生长,神经束化,细胞迁移,神经元可塑性,和发育成熟后的少量神经细胞再生补充等。哺乳动物胚胎期间神经细胞黏附分子有显著的多聚唾液酸化,随着神经系统的发育成熟多聚唾液酸化逐渐消失。但成熟大脑的室管膜下区、海马体、及视网膜区域是已知仍保存少量神经细胞再生能力的区块,因此仍表达PSA-NCAM。过往的研究发现成年鼠大脑经过各式脑损伤后室管膜下区的新生神经细胞可迁移至损伤部位,此迁移能力与神经细胞的PSA再表达呈正相关。
  本课题研究神经细胞黏附分子的多聚唾液酸化是否影响成年大鼠脑皮层的氯化钾损伤程度、海马的空间记忆能力、及皮层损伤和室管膜下区的新生神经细胞迁移之间的关联。以内源性乙酰-神经氨酸苷酶(Endo-N)探究在成年大鼠脑皮层中PSA的有无对氯化钾诱发的皮层传播性抑制(CSD)幅度大小、持续时间、和传播速度的影响,发现去除PSA后CSD的场电位去极化幅度变小,CSD持续时间增长,传播速度变慢。其次以Endo-N直接注射至大鼠海马内,研究海马神经细胞去多聚唾液酸化后对动物的空间记忆能力的影响。发现注射Endo-N使得成年大鼠在水迷宫实验中找到平台所用的时间增长,说明去除PSA后大鼠的空间记忆能力受损。对脑皮层施以持续性高浓度氯化钾刺激损伤后发现脑皮层的新生神经细胞数目增加。免疫染色鉴定证实此类新生细胞多为神经类细胞而非胶质类细胞;但去除PSA后减少了氯化钾损伤所诱发的皮层的新生神经细胞数目,意含皮层的新生细胞可能源自它处且去除PSA后降低源自它处的新生细胞的迁移能力。为验证在皮层损伤后出现的新生神经细胞是否源自室管膜下区,以带有绿色荧光基因的腺相关病毒转染并标记室管膜下区细胞,发现持续性高浓度氯化钾刺激损伤后出现在皮层的新生神经细胞仅部分带有标记室管膜下区的绿色荧光。
  结论:去除PSA加重了CSD对神经细胞的可逆性损伤,抑制PSA-NCAM阳性神经细胞的迁移能力,在海马则损伤动物的记忆能力。脑皮层的长时间高浓度氯化钾刺激损伤能够提供信号并刺激室管膜下区和RMS通路的类神经干细胞增生,并且募集部分新生神经细胞迁移至大脑皮层;而移除PSA可抑制新生神经细胞的迁移能力,因此阻碍损伤部位的神经修复。

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