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小鼠胰腺腺泡细胞钙振荡研究：M受体去敏感化的时间依赖特点及2-APB和激光强度对钙振荡的影响

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第一章 前言

1.1 胰腺腺泡细胞的结构和功能

1.2 胰腺腺泡细胞钙振荡

1.3 PACCOs的特点

1.4 PACCOs的发生机制

1.5 mAChRs与PACCOs

1.6 PACCOs的测定方法

1.7 2-氨基乙酯二苯基硼酸（2-Aminoethoxydiphenyl borate，2–APB）

1.8 本项目的研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验数据的处理和分析

第三章 实验结果

3.1 延长ACh作用时间可使mAChRs产生去敏感化现象

3.2 ACh激活的mAChRs去敏感化呈剂量依赖效应

3.3 ACh激活的mAChRs去敏感化恢复呈时间依赖性

3.4 双光子成像研究的结果也说明mAChRs去敏感化的恢复具有时间依赖性

3.5 2-APB（100?M）可改变ACh-PACCOs的波形

3.6 不同浓度2-APB与ACh同时作用对ACh-PACCOs的影响（连续三段式方案）

3.7 不同浓度2-APB与ACh同时作用对ACh-PACCOs的影响（间隔两段式方案）

3.8 不同浓度2-APB孵育后对ACh-PACCOs的影响

3.9 2-APB阻断急性分离的胰腺腺泡细胞钙库操纵性Ca2+内流

3.10 激光强度对ACh-PACCOs的影响

第四章 讨论

4.1 ACh激活的mAChRs去敏感化的时间依赖特点分析

4.2 2-APB与ACh-PACCOs

4.3 2-APB阻断胰腺腺泡细胞钙库操纵性Ca2+内流

4.4 PACCOs成像研究方法的优化

4.5 总结

结论

参考文献

硕士期间发表的论文及参加的学术活动

致谢

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摘要

背景与目的：
　　副交感神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）可通过乙酰胆碱毒蕈碱受体（M受体，mAChRs）稳定地激发胰腺腺泡细胞产生典型钙振荡（ACh-induced pancreatic acinar cell calcium oscillations，ACh-PACCOs）进而促进胰腺腺泡细胞的胰液分泌功能。胞内钙振荡的动态变化可利用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）或双光子扫描共聚焦显微镜（two-photon laser scanning microscopy，TPLSM）实时记录。本项目研究目的有三：一是以我们实验室已经建立的典型ACh-PACCOs反应模型为基础，通过精心设计的实验方案，定量地研究小鼠胰腺腺泡细胞mAChRs被ACh激活后出现去敏感化的特点，以期对ACh-PACCOs有更全面的了解。二是在此基础上，检测药物2-APB对ACh-PACCOs的影响。三是检测激光强度对ACh-PACCOs的影响，以期优化实验条件。
　　材料与方法：
　　1.小鼠胰腺腺泡细胞分离。4~6月龄昆明小鼠，经乙醚麻醉，颈椎脱臼处死后迅速取出胰腺，用胶原酶液（150~200U/ml）处理后分离得到细胞悬液备用。
　　2. LSCM/TPLSM成像与灌流给药记录。取适量胰腺腺泡细胞悬液于载物盘上，待细胞贴壁后，避光负载钙荧光染料Fluo-4-AM20 min；进而利用LSCM或TPLSM的二维连续扫描模式（XYT）记录ACh-PACCOs；相关药物的影响根据实验方案的要求通过灌流给药装置或微量喷药装置适时给予。
　　3.数据的分析处理。实验设计以自身对照为主，所有数据以均数±标准误（?X±S）表示，采用SPSS17.0统计分析软件进行数据分析，两组间比较采用两样本T检验，多组比较时用单因素方差分析，曲线拟合用EXCEL软件。P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。
　　结果与结论：
　　1. mAChRs的去敏感化研究：ACh-PACCOs可通过动态激光共聚焦钙成像结合药物灌流的方法实时直观地记录到，该反应可被1?M的阿托品完全阻断。在此基础上进一步观察到：如果延长ACh的作用时间，其所诱发的PACCOs会逐渐减弱，说明mAChRs被ACh激活后会产生去敏感化；在不同浓度（50~800nM）ACh的作用下，胞内产生的钙信号随ACh浓度的增高而增强，mAChRs去敏感化程度越明显（此为与孙娜娜同学论文中共同研究结果）。定量研究发现：在一定时间范围（0~6min）内，mAChRs去敏感化的恢复程度与间隔时间呈线性关系，这提示ACh激活的mAChRs去敏感化在撤去ACh的作用后可随时间逐渐减弱，mAChRs活性逐渐恢复，具有线性的时间依赖特点。双光子成像结合微量喷药的实验结果也得到类似的结论。
　　2.2-APB对ACh-PACCOs的影响：多种实验方案的结果都表明2-APB（10~100?M）可明显改变ACh（100nM）-PACCOs的表现形式；统计发现，2-APB在一定时间内可使ACh-PACCOs的平均钙释放量明显增大，频率明显降低，且这种效应在一定范围内随2-APB剂量增大而增强；但钙释放增强过后，细胞往往对ACh失去反应能力，需过段时间才恢复。此现象可能与2-APB可阻断钙库操纵性Ca2+内流（store operated calcium entry，SOCE）有关。
　　3.激光强度对ACh-PACCOs的影响：结果显示，与常用激光强度（一般3％）相比，加倍的激光强度（一般6%）可致ACh-PACCOs的平均钙释放量明显减弱（P<0.01）。提示：激光强度太高时，细胞活性会受到一定的影响，不利于实验的顺利进行。

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