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一氧化氮对臂丛神经根损伤大鼠脊髓功能的影响

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论文说明：英文缩略词表

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前言

1 NO在脊髓损伤中的作用

2一氧化氮合酶(NOS)在脊髓损伤中的作用

3本课题立题意义

材料和方法

1实验材料

2实验方法

结果

1 确定SNP量效曲线

2 SNP干预前后根性撕脱伤大鼠的疼痛反应变化

3应用SNP干预后受损脊髓组织nNOS蛋白水平

4 SNP干预前后脊髓运动神经元对根性撕脱伤的反应变化

5 SNP干预前后脊髓胶质细胞对臂丛根性撕脱伤的反应变化

讨论

1 NO导致运动神经元死亡加剧的机制

2 脊髓组织NO水平对撕脱伤诱导的nNOS基因表达水平的调控

3 NO增强撕脱伤诱导的疼痛反应的机制

结论

参考文献

附录　在校期间发表论文情况

参加课题情况

致谢

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摘要

目的：根性撕脱伤是臂丛损伤中最严重的一种创伤，常见于交通事故及新生儿产伤合并症。神经根撕脱后会导致损伤侧所支配的肌肉群瘫痪及严重的感觉功能障碍。神经根丝从脊髓离断会导致相应脊髓节段前角运动神经元大量死亡，因此现阶段研究主要集中在如何保护运动神经元。研究发现，撕脱伤诱导的运动神经元死亡与一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)尤其是神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)的表达有关。然而nNOS在神经性退变中所扮演的角色存在争议，一些研究认为nNOS可能具有神经毒性作用，因为nNOS的表达总是伴随着氧化应激的产生。但我们前期研究发现应用植物抗氧化剂对运动神经元的长期存活却没有很大帮助，最近我们又发现撕脱伤早期，损侧脊髓组织nNOS基因的整体表达水平是下降的，由此我们推测：损伤早期NO可能有保护运动神经元的作用。为证实这个假设，本实验在神经根撕脱伤早期应用外源性一氧化氮供体硝普钠(sodium nitro prusside,SNP)，随后观察受损脊髓c-Jun、nNOS、iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、Nestin、GFAP(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、OX-42等的表达改变，分析这些基因与运动神经元死亡的关系，进一步探讨nNOS/NO在根性撕脱伤中的作用机制。
　　 方法：成年Sprague-Dawley雄性大鼠，随机分为：NS组(臂丛神经根撕脱+normalsaline)，SNP组(臂丛神经根撕脱+SNP5mM)。右侧C5～T1神经根撕脱术后于4d和13d分别在蛛网膜下腔受损脊髓节段局部，给予NS或5mMSNP各4μl，存活2d后处死。取损伤侧C7节段脊髓，Western-Blot检测nNOS蛋白表达量。取C7节段脊髓制作冰冻切片，应用免疫组织化学以及酶组织化学、中性红染色等方法，定量存活运动神经元数以及nNOS、c-Jun蛋白在运动神经元的表达情况；同时检测iNOS、Nestin、GFAP、OX-42在胶质细胞的表达情况。所有定量数据均记为均数±标准差(x±s)，以中山大学统计学教研室提供的SPSS软件分析上述各指标的组间差异，分析c-Jun或nNOS表达程度与运动神经元存活的相关关系。以期明确NO/nNOS在臂丛根性撕脱伤中的作用地位和相关机制。P≤0.05被认为有统计学意义。
　　 结果：①SNP40mM以上剂量局部应用局部会导致动物立刻死亡，臂丛撕脱术后15d各组运动神经元nNOS阳性率(％)：NS组为54.78±3.30，2.5mM为32.04±1.06，5mM为30.35±3.21，10mM为25.16±1.00，20mM为20.18±0.60，各种浓度的SNP均能降低运动神经元的nNOS阳性率；运动神经元存活率(％)为：NS组为81.52±1.78，2.5mM为60.02±1.89，5mM为60.36±3.58，10mM为38.58±1.37，20mM为29.95±1.52；SNP10mM以上高浓度组的细胞毒性显著大于低浓度组，p均＜0.01；因此我们选择了5mM做为最终SNP浓度。②SNP加剧根性撕脱伤引起的患肢的疼痛反应，使得热刺激撤足潜伏期(s)6d时间点大鼠右侧前肢从正常组的17.47±2.36，降为NS组的14.03±2.83，SNP组的8.71±0.55，15d时间点由正常组的17.4±2.86降为NS组的16.82±3.46和SNP组的9.87±2.11，两时间点SNP组与其他组的差异均有非常显著性意义。③SNP减少撕脱伤脊髓运动神经元的存活率(％)：6d时间点两组间无显著差异；15d时间点，SNP组(57.41±3.96)显著低于NS组(81.48±2.53)，t=12.862，p＜0.001。④Western-Blot检测脊髓nNOS蛋白表达水平：6d和15d时间点NS组和SNP组之间均无明显差异；NADPH-d酶组织化学和nNOS免疫组化检测nNOS阳性神经元的分布一致，损伤侧前角nNOS阳性运动神经元阳性率(％)：6d时间点SNP组(20.78±2.36)比NS组(11.54±4.85)显著增多；15d时间点SNP组(30.25±2.11)显著低于NS组(54.66±5.53)；损伤侧存活运动神经元nNOS阳性率(％)：6d时间点SNP组(23.62±3.02)比NS组(12.76±5.38)显著增多，15d时间点SNP组(52.82±5.23)显著低于NS组(66.81±5.25)；存活相关分析显示：两个时间点无论是运动神经元nNOS阳性率或存活运动神经元nNOS阳性率都与存活运动神经元数目间均呈显著性正相关(p均＜0.05).⑤SNP干预前后c-Jun阳性运动神经元数目：6d时间点NS组150.33±15.47，SNP组136.5±10.09，差异无显著性，15d时间点SNP组111.57±16.82显著低于NS组136.14±12.89，t=3.068，p＜0.01。相关分析显示：两个时间点的c-Jun阳性神经元的数目与存活运动神经元数目之间相关性均没有统计学意义(p均＞0.05)；但是综合两时间点数据进行相关性分析，c-Jun阳性神经元的数目与运动神经元存活数目之间存在显著正相关(r=0.633，p＜0.01)。⑥iNOS免疫组化显示15d时NS组撕脱侧胶质细胞仅部分激活，胞体变大，可见少量粗短突起；SNP组胶质细胞数量明显增多，胞体肥大，分枝状突起变短甚至消失。撕脱侧背角浅层iNOS表达明显增强。15d时损伤侧iNOS单位面积的平均灰度值：在前角NS组为159.44±2.64，SNP组115.42±1.15；后角胶状质NS组为153.36±1.53，SNP组为112.61±1.13；损伤侧前角和胶状质两组间差异均有显著意义，p均＜0.01。⑦撕脱伤引起的小胶质细胞和星形胶质细胞反应与NS组相比，均呈过度激活状态，细胞数量明显增多，胞体变大，突起变粗变短甚至消失；Nestin阳性胶质细胞集中分布在损伤侧前角和后角浅层，在脊髓前角围绕损伤运动神经元胞体，形成以前角运动神经元神经元群为特征的Nestin阳性反应胶质细胞群，白质内以神经根进出脊髓处最明显，SNP组后角出现阳性细胞；GFAP阳性星形胶质细胞以损伤侧白质和前角灰质为主，白质阳性反应星形胶质细胞围绕损伤节段的边缘，形成一个阳性反应圈，SNP组阳性反应圈增大，分布更广泛，后角变化不明显；OX-42阳性小胶质细胞主要在损伤侧的灰质，NS组主要位于前角和白质的前索和侧索，SNP组分布更加广泛，扩散到脊髓背角，小胶质细胞突起环绕神经元呈提蓝状。
　　 结论：臂丛根性撕脱伤早期受损脊髓局部应用外源性NO：①加剧患肢疼痛反应；②加剧损伤脊髓的胶质反应；减少c-Jun表达。③使运动神经元死亡时间提前，死亡程度增加。④使前角运动神经元nNOS表达时间提前，且nNOS在运动神经元的表达量与运动神经元的存活，成正相关关系。

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