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通过CD123分子靶向白血病干细胞治疗急性髓性白血病的病毒-基因治疗策略及研究

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引 言

第一部分病毒融合基因包膜糖蛋白对急性髓性白血病细胞的毒性效应及其机制研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二部分以辛德毕斯病毒载体为基础的靶向治疗急性髓性白血病的研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第三部分腺病毒重靶向白血病干细胞的研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

总结与展望

参考文献

附录

致谢

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摘要

急性髓系白血病(AcuteMyeloidLeukemia，AML)是失去正常定向分化功能的非成熟的白血病细胞在体内堆积而产生异常造血的一种克隆性疾病，在我国是最常见的恶性血液病。AML每年的发病率为1.8/10万人，65岁以上老年人的发病率已增加到17.2/10万人。虽然发现了许多新的白血病治疗方案及药物，但绝大多数的患者仍会死于这种疾病。目前认为在白血病患者体内存在一群白血病干细胞(LeukemicStemCell，LSC)，由于LSCs处于静止期，使目前的化学药物治疗只能杀灭晚期白血病细胞，但是残留的LSCs会继续无限增殖，分化产生白血病母细胞群，导致AML患者在治疗达到完全缓解后往往还会复发。因此为了解决白血病治疗后早期复发的问题，提高患者长期生存率，只有针对LSCs的靶向治疗才是AML最有效、最根本的治疗策略。 有人认为，CD123是目前发现的最具有开发潜力的特征性抗原之一。除单克隆抗体外，已有研究应用细胞因子与细胞毒药物融合的方法来治疗AML。这种方法能对白血病祖细胞和LSC群产生毒性作用，而对正常前体细胞无毒性。LSC表面抗原的识别和靶向治疗，是一个很有价值的研究方向。CD123即人IL—3受体(IL—3receptor，IL—3R)是一个异二聚体结构，其α亚基同配体结合至关重要，其普通β亚基同高亲和力配体结合有关，并介导信号转导。有报道显示，急性髓系白血病患者的CD34+/CD38-细胞高表达IL—3受体α链(CD123)，而HSCs不表达或弱表达。CD34+/CD123+细胞亚群被植入到非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性(NOD/SCID)小鼠体内，可诱发小鼠AML的发生，CD123被认为是LSC的一个非常重要的靶，提示CD123可作为细胞毒药物作用的靶点。因此以CD123为靶进行白血病的治疗，不仅可以清除LSC而且还不会对造血干细胞(HematopoieticStemCell，HSC)造成损伤，是AML治疗的有效方案。 白血病的基因靶向治疗是一种值得探索的方案。有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定的表达，病毒载体介导的基因转移以其高转染效率和良好的靶向性而成为基因治疗中应用最广泛的技术手段。基因治疗涉及靶基因、靶基因载体和靶基因的表达调控。在本课题的研究中我们利用CD123分子作为靶，运用分子生物学的技术和手段对病毒载体进行修饰或加工使其能够充分地靶向白血病母细胞群及白血病干细胞，以期达到治疗白血病的目的。 本研究分三部分： 1、靶基因的选择 首先我们通过体外的细胞实验确定了对细胞有明显毒性作用的靶基因即长臂猿白血病病毒的融合基因包膜糖蛋白(GibbonApeleukemiavirus，GALV—FMG)，研究结果显示GALV—FMG在AML细胞株HL—60细胞中的表达可诱导细胞发生融合，形成多核合胞体，融合指数在转染后的96h达到53.2±5.7％，和空载体转染组及空白组相比有显著的差别(P<0.05)。多核合胞体的形成可引起伴随ATP消耗的线粒体失能，导致细胞发生坏死性死亡，PI染色发现死亡的多核合胞体在第5天达到总合胞体的约70％，而乳酸脱氢酶的活性在同样的时间里也达到了约80％。说明多核合胞体的不断形成导致了细胞死亡的不断发生。我们通过AO/EB染色也发现GALV—FMG转染组的HL—60细胞表现为大量的坏死。GALV—FMG的表达引起细胞发生死亡的机制与HSP70的表达增加有关，我们的研究发现GALV—FMG的表达不仅可以诱导HSP70的表达增高，而且还可以通过阻断IκBα的降解来抑制NF—κB活性和核转位，而NF—κB的抑制被发现又可以负调控HSP70的表达。因此GALV—FMG可通过抑制NF—κB对HSP70的表达产生正反馈的作用。根据上述实验结果就选定了GALV—FMG基因作为进行白血病基因治疗的靶基因。 2、重组辛德毕斯病毒载体的构建及研究 GALV包膜糖蛋白含有表面单位(SU)和转膜元件(TM)二个部分。肿瘤基因治疗的一个很重要的目标就是发现新的靶向性的细胞毒基因。由于IL—3的α受体(即CD123)是白血病干细胞上最有显著特异性的标记，因此我们通过分子生物学的方法将IL—3配体在GALV的表面单位显示并与其进行融合以增强GALV—FMG的靶向性。 但是对于肿瘤的治疗来说，将GALV—FMG融合基因发展成为一个治疗基因所存在的困难就是难以产生高滴度的病毒用作基因转移的载体。有研究发现辛德毕斯病毒比较适合作为转移GALV—FMG融合基因的载体，我们的实验结果也表明编码IL—3-GALV融合基因的重组辛德毕斯病毒载体在BHK细胞中被包装时可产生高滴度的病毒，并对HL—60细胞和原代人的AML细胞可产生杀细胞效应，细胞表现为明显的坏死(活细胞率分别为：52.5±4.7％，17.8±2.8％)，而对K562细胞基本没有影响(活细胞率为：94.3±3.9％)。体内体外实验也进一步说明了融合基因IL—3-GALV的表达增强了辛德毕斯病毒抗白血病的效应，并具有攻击白血病干细胞的潜力。 3、腺病毒重靶向白血病干细胞的研究 鉴于目前最常用的基因转染载体还是腺病毒(Ad)，因此我们对如何优化腺病毒用于白血病的基因治疗也进行了一定的探索。以CD123分子作为靶，通过分子生物学技术构建并表达接合分子CAR—hIL—3的策略，使有生物学活性的接合分子在与腺病毒结合后使其特异性地靶向细胞表面的CD123分子，从而介导病毒对白血病母细胞群及干细胞的转染。克服了白血病细胞由于缺乏柯萨基—腺病毒受体(CAR受体)而对腺病毒产生抗性的问题，增加了腺病毒感染的范围和特异性，可以使腺病毒具有专一的靶向性。我们的结果证实了CAR—hIL—3融合蛋白介导的腺病毒可以有效地转染表达CD123的原代白血病细胞(转染率为：94.6±3.5％)，和单独的腺病毒转染(转染率为：26.9±5.4％)相比有显著差异(P<0.05)。体外体内实验也证明了和单独的Ad—GFP相比(GFP+克隆百分比分别为10.25±2.65％，3.54±1.23％)，CAR—hIL—3融合蛋白介导的腺病毒具有转染白血病干细胞的潜力(GFP+克隆百分比分别为88.56±6.59％，58.68±3.24％)，并在体内可减少与腺病毒载体系统注射有关的肝毒性反应。 以上研究结果为靶向白血病干细胞治疗白血病的研究提供了新的视角，是以CD123为靶的针对LSC的靶向治疗新方法，对克服白血病耐药、复发及清除微小病灶等，提供了新的治疗策略及实验依据。同时也为辛德毕斯病毒载体及腺病毒载体在白血病干细胞基因治疗领域中的应用开辟了新的道路。

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