TGF-β/Smad信号蛋白在糖尿病肾病发病机制中的作用

代理获取

页面导航

目录
摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，也是西方国家终末期肾病(ESRD)的首位病因。已有的研究表明，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可刺激肾实质细胞的肥大，并通过增加细胞外基质的合成，减少细胞外基质的降解而导致肾小球系膜区及肾小管．间质细胞外基质的积聚，最后导致肾小球硬化、肾小管．间质纤维化和肾血管硬化，发生肾衰竭。应用抗TGF-β抗体或TGF-β反义寡核苷酸治疗可显著减少细胞外基质的积聚，减轻肾脏纤维化。有足够的证据提示TGF-β在糖尿病肾病的发生发展过程中发挥关键作用。目的：探讨链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导的大鼠糖尿病肾病模型肾组织中Smad信号蛋白的活化状态。方法：1、动物分组和模型建立：雄性SD大鼠48只，体重200-250g，分别于成模后4、6、8、10、12、14、16周杀检6只。另设正常对照组6只。雄性SD大鼠禁食16h后腹腔注射STZ(60mg／kg体重)，并于开始注射STZ后72h后取大鼠尾静脉血测血糖，凡血糖≥16.7mmol／L确定为糖尿病大鼠模型制作成功。对照组腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。2、检测指标：观察大鼠一般情况，测体重、肾重、血糖、血压、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小时尿量；留取大鼠肾组织做PAS及Masson染色；用RT-PCR检测大鼠肾组织TGF-β 1、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平;免疫组织化学检测大鼠肾组织中p-Smad2／3、α-SMA和E-cadherin的表达；Western-blot检测大鼠肾组织α-SMA和E-cadherin的蛋白表达水平。结果：1、大鼠糖尿病肾病模型的建立。腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠出现明显的多食、多饮、多尿和体重下降等糖尿病症状，血糖明显升高，肾小球体积增大，肾重／体重比值增加，肾小球基底膜增厚，系膜基质明显增宽，尿白蛋白排泄率明显增加，血肌酐水平增高，表明大鼠糖尿病肾病模型已成功建立。2、大鼠糖尿病肾病肾内TGF β／Smad信号蛋白的活化状态。与对照组大鼠相比，糖尿病大鼠肾脏组织内TGF-β 1、Smad2和Smad3 mRNA水平显著增高。正常大鼠肾小管上皮细胞有p-Smad2／3的基础表达，随着糖尿病病情的进展，p-Smad2／3在糖尿病形成后6周显著增高，高峰出现在8周和16周。3、大鼠糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化。第二节　两种糖尿病动物模型肾组织中Smad蛋白活化状态的对比研究目的：对比两种糖尿病肾病动物模型肾组织中Smad蛋白活化状态。方法： 1、动物分组：将40只雄性SD大鼠(160-210g)随机分成4组，A组：正常对照组(Con组,n=8)，注射枸橼酸缓冲液；B组：单肾切除组(Nx组，n=8)，大鼠接受右侧肾切除术，2周后腹腔注射枸橼酸缓冲液；C组：糖尿病肾病组(DM组，n=12)，单剂量腹腔注射STZ(60 mg／kg体重)：D组：单肾切除+糖尿病组(DMNx组，n=12)，大鼠接受右侧肾切除术，2周后单剂量腹腔注射STZ(50mg／kg体重)。观察16周后收集标本。2、检测指标：观察大鼠一般情况，各组大鼠测体重、肾重、血糖、血压、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小时尿量；留取各组大鼠肾组织做PAS及Masson染色；用RT-PCR检测各组大鼠肾组织TGF-β<,1>、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平；免疫组织化学检测各组大鼠肾组织中p-Smad2／3、α-SMA和E-cadhefin的表达；Western-blot检测各组大鼠肾组织α-SMA和E-cadherin的蛋白表达水平。结果：1、两种糖尿病肾病动物模型一般情况的比较。与DM组相比较，DMNx组大鼠肾重／体重比值增加，系膜基质明显增多，尿白蛋白排泄率明显增加。DMNx组大鼠肾小管间质出现局灶性纤维化。但两组之间的血压，血肌酐水平差异无显著性。2、两种糖尿病动物模型肾组织中Smad蛋白活化状态的比较。与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾脏组织中。TGF-β<,1>、Smad2和Smad3 mRNA的表达水平均显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显。与Con组及Nx组相比较，DM组与。DMNx组大鼠肾小管上皮细胞p-Smad2／3的蛋白表达水平显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显。3、两种糖尿病动物模型肾小管上皮细胞转分化的比较。与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾脏组织中α-SMAmRNA的表达水平均显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显；而E-cadherin mRNA的表达水平显著降低，且DMNx组较DM组降低更明显。免疫组织化学及Westernblot结果表明，与Con组及Nx组相比较，DM组与DMNx组大鼠肾小管上皮细胞α-SMA的蛋白表达水平显著增高，且DMNx组较DM组升高更明显；而E-cadherin的蛋白表达水平显著降低，且DMNx组较DM组降低更明显。结论：单肾切除后STZ诱导的糖尿病肾病模型与单纯STZ诱导的糖尿病肾病模型均存在Smad信号蛋白的活化及肾小管上皮细胞转分化，且前者的活化程度及转分化程度均强于后者。第二章TGF-β<,1>和高糖对肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响第一节TGF-β<,1>对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响目的：探讨TGF-β<,1>对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响。方法：1、细胞培养：待生长状况良好的NRK52E细胞60-80％贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后给予不同浓度和时间TGF-β<,1>刺激。2、指标检测：采用免疫细胞化学方法检测0、2、4、8、10ng／ml的TGF-β<,1>浓度刺激30分钟，以及TGF-β<,1>(10ng／ml)刺激0、15min、30min、lh、3h后p-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测0h、6h、12h、24h、48h、72h，120不同时间点Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表达；Western blot方法检测Oh、24h、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin蛋白的表达水平。结果：与刺激前比较，TGF-β<,1>以时间和剂量依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，高峰发生在30min(73.1％VS 15.8％阳性细胞百分数)；与刺激前比较TGF-β<,1>以时间依赖方式上调Smad2、Smad3、Smad7和Collagen I mRNA的表达，上调α-SMA mRNA和蛋白的表达，下调E-Cadherin mRNA和蛋白的表达。结论：TGF-β<,1>能活化近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白，并促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质的生成。第二节高糖对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响目的：探讨高糖对近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白的影响。方法：1、细胞培养：待生长状况良好的NRK52E细胞60-80％贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后分高糖组(35mmol／L)和甘露醇对照组(35mmol／L)。2、指标检测：采用细胞免疫化学方法检测5.5、15、25、35、45mmol／L不同葡萄糖浓度刺激24h，以及高糖刺激0、15min、30min、lh、3h、6h、12h、24h、48h后p-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Oh、12h、24h、48h、72h不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表达。结果：与刺激前和甘露醇对照组比较，高糖明显上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，高峰在24小时；上调Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA和CollagenI mRNA的表达；下调E-Cadherin mRNA的表达。结论：高糖能活化近端肾小管上皮细胞Smad信号蛋白，并促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质的生成。第三章Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质合成的影响目的：探讨Smad7对高糖介导肾小管上皮细胞转分化的影响。方法：1、强力霉素(Dox)调控Smad7表达NRK52E细胞株的构建：应用lipofect 2000将含有小鼠全长Smad7 cDNA的Tet-on质粒系统先后转染至正常大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)，G418培养基和含有潮霉素的培养基两轮筛选后，最后通过鉴定选择Smad7表达受Dox调控的克隆，扩增后冻存备用。2、细胞培养：待生长状况良好的转染Smad7的NRK52E细胞株60％-80％细胞贴壁后，无血清培养基同步24小时，然后分为Dox诱导组和对照组，前者给予Dox(2ug／m1)诱导24h后，给予高糖刺激，后者不加Dox诱导。3、指标检测：采用免疫细胞化学方法检测高糖刺激0、24h后p-Smad2／3核转位情况；RT-PCR检测Oh、12h、24h、48h、72h不同时间点Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin和Collagen ImRNA的表达；Western blot方法检测Oh、48h、72h不同时间点α-SMA、E-cadherin和Collagen I蛋白的表达水平。

著录项

作者
孙惠力;
展开▼
作者单位

中山大学;

展开▼
授予单位中山大学;
学科内科学
授予学位博士
导师姓名尹培达;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肾小管、肾小球疾病;糖尿病;
关键词
糖尿病肾病; 转化生长因子; Smads信号蛋白; Ⅰ型胶原; 葡萄糖;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. TRAF-6调控TGF-β1-Smad2/Smad3信号通路在Graves病免疫发病机制中的作用 [J] . 谭燕 ,郑晓雅 ,李莎 . 中国免疫学杂志 . 2019,第009期
2. TGF-β、Smad信号通路蛋白及α-SMA在糖尿病肾病患者肾组织中的表达和意义 [J] . 房勃龙 ,韩鸿玲 ,张鹏 . 天津医药 . 2013,第011期
3. TGF-β/Smad、p38MAPK及JNK/SAPK信号通路在糖尿病肾病发生发展中作用机制的研究进展 [J] . 陈方旭 ,米焱 ,王彩丽 . 山东医药 . 2019,第009期
4. 去乙酰化蛋白酶1在马兜铃酸肾纤维化模型中对TGF-β1/Smad7信号通路的作用 [J] . 杨洋 ,张中文 ,姚华 . 畜牧兽医学报 . 2012,第003期
5. 抑制性蛋白在TGF-β/Smad信号通路及支气管哮喘气道重塑中的作用 [J] . 贺孝良 ,李昌崇 . 中华哮喘杂志（电子版） . 2009,第001期
6. TGF-β/Smad信号在糖尿病肾病中的重要作用 [C] . 陈海勇 . 世界中医药学会联合会内分泌专业委员会第一届国际中医内分泌学术会议 . 2014
7. TGF-β/Smad信号通路在小鼠肺纤维化发病机制中的作用及对FN、OPN表达的影响 [A] . 陈丽丽 . 2015

TGF-β/Smad信号蛋白在糖尿病肾病发病机制中的作用

目录

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅