晶状体上皮细胞氧化损伤模型中酸性β—葡萄糖苷酶和鞘脂酶激活蛋白C的表达

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多种因素共同作用导致白内障形成，在此过程中几个事件联合起来共同诱导晶状体一系列的病理生理学改变，包括晶状体上皮细胞、纤维细胞膜成分和通透性改变、水电解质紊乱、晶状体蛋白质翻译后修饰及细胞凋亡途径启动等等，最终导致晶状体混浊。动物的体内及体外试验和临床研究有力显示：氧化损伤的加重和白内障的发展有关，在形成白内障的反应链中，一般认为氧自由基造成的损伤作为启动因素触发后续一系列反应。本文针对体外培养的人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞，用一定浓度的过氧化氢(H2O2)作用于细胞构建氧化损伤模型，然后以半定量RT-PCR和免疫细胞化学的方法检测细胞中的酸性β-葡萄糖苷酶(GCase)和鞘脂酶激活蛋白C(SaposinC)的含量变化，旨在探讨此两种与晶状体上皮细胞膜上脂质构成密切相关的物质是否与氧化应激过程相关，进一步探寻白内障形成机制的线索。研究共分4部分，简述如下。第1部分H2O2诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤模型的建立目的：研究不同浓度H2O2对人晶状体上皮细胞系HLE-B3生长抑制及对细胞形态学的影响，确定体外氧化损伤模型适宜的H2O2浓度。方法：H2O2设5个浓度梯度，分别为100，200，400，800和1600μM，作用于细胞24小时，用MTT法检测不同浓度下细胞的抑制率。显微镜下观察氧化应激状态下细胞的形态学改变。结果：MTT法测得H2O2对HLE-B3细胞的半数抑制浓度为800μM。800μMH2O2处理使细胞增殖受抑制，细胞形态改变。结论：H2O2抑制人晶状体上皮细胞系HLE-B3的增殖，抑制率呈现剂量依赖性；IC50为800μM。第2部分半定量RT-PCR检测GBA和Prosaposin在晶状体上皮细胞系的表达目的：研究体外培养的正常人晶状体上皮细胞和氧化应激下人晶状体上皮细胞中GBA和Prosaposin基因在mRNA水平的表达情况。方法：800μMH2O2分别作用于人晶状体上皮细胞系HLE-B324，48，72小时。RT-PCR法检测GBA和Prosaposin基因在正常对照组和3个处理组中的表达情况。结果：GBA在24h时表达量即有明显降低；ProsaposinmRNA表达在24h和48h均没有明显改变，而在72h时表达明显增强。结论：800μM过氧化氢处理晶状体上皮细胞后，GBAmRNA转录减少，在24h即达最低；过氧化氢处理72h后始见ProsaposinmRNA转录增加。第3部分免疫细胞化学法检测GCase和SaposinC在晶状体上皮细胞中的表达目的：探讨GCase和SaposinC在晶状体上皮细胞中的表达。方法：800μMH2O2作用24小时后免疫细胞化学法检测GCase的表达；800μMH2O2作用72小时后免疫细胞化学法检测SaposinC的表达。结果：HLE-B3细胞浆内两种蛋白均有表达，在上述处理下GCase的表达降低，SaposinC的表达升高。结论：氧化应激状态下晶状体上皮细胞内GCase的表达降低，SaposinC上调。第4部分流式细胞仪检测H2O2处理后HLE-B3细胞调亡目的：探讨H2O2是否诱导HLE-B3细胞诱导凋亡。方法：实验组细胞分别以800μMH2O2作用24，48，72小时；流式细胞仪检测实验组和对照组细胞凋亡率。结果：800μMH2O2处理24，48，72小时后凋亡率分别为10.1％(p＜0.01)、13.0％(p＜0.01)、20.1％(p＜0.01)。结论：800μMH2O2可诱导HLE-B3细胞产生凋亡，且凋亡率呈时间依赖性。

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作者
李秀梅;
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作者单位

中山大学;

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授予单位中山大学;
学科眼科学
授予学位硕士
导师姓名张振平;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类白内障;
关键词
晶状体上皮细胞; 鞘脂酶激活蛋白; 酸性β—葡萄糖苷酶; 白内障; 过氧化氢;

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