一个新的稻瘟病菌致病相关基因MoDUO1的鉴定及功能分析

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第一章 前言

1 稻瘟病与稻瘟病菌

1.1 稻瘟病菌的侵染循环

1.2 稻瘟病菌致病相关基因的研究

1.3 稻瘟病菌功能基因组学

2 细胞有丝分裂与动粒蛋白复合体

2.1 细胞有丝分裂(mitosis)

2.2 动粒蛋白复合体结构

2.3 动粒功能的调控

3 本研究的主要内容和目的意义

第二章 材料与方法

2.1 试验用菌株

2.1.1 细菌及真菌菌株

2.1.2 菌种保存

2.2 试验用质粒载体

2.3 培养基及培养条件

2.3.1 大肠杆菌培养基

2.3.2 稻瘟病菌培养基及培养条件

2.4 抗生素、常用实验室生化试剂及其使用浓度

2.5 分子生物学实验

2.5.1 PCR扩增

2.5.2 重组质粒的构建及鉴定

2.5.3 质粒拯救法扩增T-DNA插入位点侧翼序列

2.6 稻瘟病菌生物学性状研究

2.6.1 菌落生长速率测定及特征观察

2.6.2 气生菌丝及产孢机构显微形态观察

2.6.3 分生孢子形成及产孢量测定

2.6.4 分生孢子萌发及附着胞形成

2.6.5 洋葱表皮的穿透试验

2.6.6 稻瘟病菌染色观察

2.6.7 稻瘟病菌对水稻致病性测定

2.6.8 稻瘟病菌菌丝体、分生孢子及附着胞GFP荧光观察

2.7 稻瘟病菌的转化

2.7.1 稻瘟病菌原生质体的制备

2.7.2 原生质体的转化

2.8 稻瘟病菌总RNA的提取

2.9 定量PCR

2.9.1 cDNA第一链的合成

2.9.2 RT-PCR

2.10 稻瘟病菌总DNA的提取及分析

2.10.1快速小量提取稻瘟病菌总DNA

2.10.2大量提取稻瘟病菌总DNA

2.11 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交(DIG法)

2.12 基因序列分析

2.13 稻瘟病菌总蛋白质的提取及纯化

2.14 真菌总蛋白质的2-DE及质谱分析

2.14.1 第一向等电聚焦(IEF)

2.14.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.14.32-DE胶蛋白质点的检测及图像分析

2.14.4 蛋白胶内酶解及质谱分析

第三章 稻瘟病菌T-DNA插入突变体YO552的筛选鉴定

3.1 引言

3.2 结果

3.2.1 突变体YO552的生长特性

3.2.2 突变体YO552的产孢特性

3.2.3 突变体YO552对洋葱表皮侵染及致病性

3.2.4 突变体YO552的质粒拯救及插入位点侧翼序列

3.2.5 突变体插入位点侧翼序列

3.2.6 插入突变体的基因功能互补

3.2.7 稻瘟病菌MoDUO1基因的分离、功能结构域和同源性分析

3.3 小结

第四章 稻瘟病菌染色体外层动粒蛋白组分MoDuolp的功能

4.1 引言

4.2.MoDUO1基因的细胞定位

4.2.1 MoDUO1-eGFP融合载体的构建及转化

4.2.2 MoDUO1基因的表达定位及时序表达

4.3 MoDUO1基因缺失突变体的构建

4.3.1 MoDUO1基因缺失载体的构建

4.3.2 ⊿MoDUO1突变体的获得

4.3.3 互补载体的构建及互补株的获得

4.3.4 ⊿MoDUO1 mRNA表达水平的验证

4.4 ⊿MoDUO1的生物学表型观察

4.4.1 ⊿MoDUO1突变体菌落生长速率

4.4.2 ⊿MoDUO1突变体产孢量及分生孢子形态

4.4.3 ⊿MoDUO1突变体分生孢子萌发及附着胞形成

4.5 MoDUO1基因缺失对稻瘟病菌细胞核数量的影响

4.6 MoDUO1基因缺失对糖原沉积及转移的影响

4.7 ⊿MoDUO1突变体的侵入行为与致病性

4.8 MoDUO1基因缺失对稻瘟病菌蛋白质表达的影响

4.9 小结

第五章 讨论及展望

5.1、讨论

5.1.1 DASH_DUO1结构域为真菌进化上的保守结构域

5.1.2 DASH复合体DUO1亚基为稻瘟病菌生长发育过程的必需蛋白组分

5.1.3 MoDuolp是稻瘟病菌分生孢子有丝分裂的重要调控因子

5.1.4 稻瘟病菌MoDuolp与其它蛋白相互作用共同调控细胞有丝分裂

5.1.5 稻瘟病菌MoDuolp是一个潜在的抗稻瘟病菌药物靶标

5.2 展望

5.3 本研究的创新点

附章_稻瘟病菌高效基因打靶系统的构建

1 引言

2 稻瘟病菌MoLIG4基因演绎的蛋白质氨基酸序列分析

3 稻瘟病菌MoLIG4基因缺失载体的构建

4 稻瘟病菌MoLIG4基因缺失突变体的获得

5 稻瘟病菌MoLIG4基因缺失不影响稻瘟病菌生物学特性及致病性

6 稻瘟病菌MoLIG4基因缺失突变对基因打靶效率的影响.

6.1 含新霉素抗性基因的稻瘟病菌MoDUO1、MoDAM1基因缺失载体构建

6.2 基因打靶效率检测

7 讨论与结论

参考文献

附录1 本研究中使用的质粒载体

附录2 本研究中使用到的抗生素、常用实验室生化试剂及其使用浓度

附录3 本研究中使用的PCR引物

附录4 DNA片段的凝胶回收.

附录5 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交(DIG法)

附录6 缺失稻瘟病菌MoDUO1基因差异表达蛋白质质谱分析结果

致谢

攻读博士学位期间完成的研究论文