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趋化因子CXCL12和受体CXCR4/CXCR7在植入性胎盘组织中的表达及其作用机制

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本研究首先通过检测CXCL12、CXCR4和CXCR7在孕晚期植入性胎盘组织标本中的表达情况，探讨CXCL12、CXCR4和CXCR7与胎盘植入的关系;其次检测分析孕晚期胎盘植入孕妇分娩前血CXCL12水平，探讨CXCL12能否成为预测胎盘植入血生化指标;再利用慢病毒介导RNA干扰/过表达技术，构建稳定沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白的单克隆滋养细胞株，探索抑制或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后对滋养层细胞生物行为的影响;同时探索CXCL12、CXCR4和CXCR7对滋养细胞侵袭力调控的可能下游蛋白和信号通路，为胎盘植入的诊断和治疗提更多供理论依据和新的方向。 第一部分 趋化因子CXCL12和受体CXCR4/CXCR7在植入性胎盘组织中的表达及意义 目的：检测CXCL12、CXCR4和CXCR7在孕晚期植入性胎盘组织标本中的表达情况，探讨CXCL12、CXCR4和CXCR7与胎盘过度侵袭的关系。 方法：采用病例对照研究的方法，回顾性研究2010年1月-2015年12月在广西医科大学第一附属医院住院分娩的孕晚期胎盘植入孕妇39例，选取孕周匹配的健康剖宫再孕孕妇39例作为对照组。分为:①植入部位组;②非植入部位组;③正常组。应用免疫组织化学染色的方法，分析各组胎盘组织蜡块中CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白的分布和表达水平，同时通过病例电子系统收集相关临床资料。 结果：1）胎盘植入组子宫切除率明显高于对照组;2)CXCL12及受体CXCR4和CXCR7蛋白主要表达在胎盘滋养层细胞;3）免疫组织化学染色评分显示植入部位组与非植入部位组比较，CXCL12、CXCR4和CXCR7评分差异无统计学意义(CXCL12:P=0.724;CXCR4:P=0.609;CXCR7:P=0.745)，与对照组比较，植入部位CXCL12、CXCR4和CXCR7评分显著升高(CXCL12:P＜0.001;CXCR4为:P＜0.001;CXCR7:P＜0.001);4)CXCL12、CXCR4和CXCR7的评分随植入深度的加深（粘连组、植入组、穿透组）呈显著上升趋势(P＜0.001)结论趋化因子CXCL12及受体CXCR4/CXCR7在植入性胎盘滋养细胞中高表达，其表达强度与滋养细胞的侵袭深度密切相关，CXCL12、CXCR4和CXCR7在胎盘植入的发展中可能发挥着重要的作用。 第二部分 趋化因子CXCL12在胎盘植入孕妇血循环的水平及意义 目的：检测CXCL12在孕晚期胎盘植入孕妇循环血液和胎盘滋养细胞的水平，探讨血CXCL12能否成为预测胎盘植入血生化指标。 方法：采用病例对照研究的方法，选取2016年1月-2017年9月在广西南宁市三所三甲医院病产前和术后病理均诊断为胎盘植入（33例，其中10例胎盘穿透，14例胎盘植入，9例胎盘粘连）的孕妇进行研究，33例前置胎盘和33例剖宫再孕的孕妇根据孕周配对成为对照。分为:①胎盘植入组;②前置胎盘组;③正常对照组。应用ELISA方法检测各组孕妇分娩前血浆CXCL12水平，免疫组织化学染色的方法检测各组胎盘滋养细胞CXCL12水平，同时收集各组孕妇相关临床资料。 结果： 1）与前置胎盘组（2249.02±501.97 pg/mL）和正常对照组(2207.42±441.84 pg/mL)相比，胎盘植入组血浆中CXCL 12水平显著升高（3144.19±701.56 pg/mL），差异有统计学意义(P＜0.001);2）比较胎盘穿透组（3476.09±49.73 pg/mL）、胎盘植入组（3046.89±643.40 pg/mL）和胎盘粘连组（2926.76±898.69pg/mL）的血浆CXCL12水平，差异无统计学意义P＞0.05）;3）胎盘植入组、前置胎盘组和正常对照组的孕妇血循环CXCL12水平与胎盘滋养细胞CXCL12表达的相关性分别为r=0.789，(P＜0.001); r=0.355 (P=0.043)和r=0.649 (P＜0.001); 4)诊断性试验结果:曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)为0.879 (95％CI: 0.794-0.964)，血CXCL12辨别植入的最佳阈值为2581.12 pg/mL，其灵敏度为87.9％，特异性为78.8％。@@结论胎盘植入孕妇血液中CXCL12水平显著升高，胎盘滋养细胞CXCL12的高表达可能是血CXCL12的重要来源，CXCL12有潜力可能成为胎盘植入的预测生化指标。 第三部分 沉默/过表达CXCL12，CXCR4和CXCR7基因对滋养细胞的调控作用 目的：探讨沉默/过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后对绒毛外滋养细胞株HTR-8/SVneo和人胎盘绒毛癌细胞株JAR增殖、迁移侵袭、细胞凋亡生物学功能的影响。 方法：1）利用慢病毒介导RNA干扰/过表达技术，将shRNA或CXCL12、CXCR4和CXCR7基因导入绒毛外滋养细胞株HTR-8/SVneo和人胎盘绒毛癌细胞株JAR中，经过抗性筛选，建立稳定沉默和稳定过表达的单克隆滋养细胞株;2）应用实时荧光定量RT-PCR及Western Blot法检测沉默/过表达效果;3）CCK8试验检测细胞增殖;4）划痕实验检测细胞迁移能力;5）Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力;6）流式细胞技术检测细胞凋亡。 结果：1）成功构建稳定沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7蛋白的滋养细胞株，分为沉默组:HTR-8/SVneo和JAR/shCXCL12、HTR-8/SVneo和JAR/shCXCR4和HTR-8/SVneo和JAR/shCXCR7;表达组:HTR-8/SVneo和JAR/OE-CXCL12、HTR-8/SVneo和JAR/OE-CXCR4和HTR-8/SVneo和JAR/OE-CXCR7;过表达阴性对照组（过表达空载转染）;沉默阴性对照组（sh空载转染）和空白对照组。2）过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后HTR-8/SVneo和JAR细胞增值率明显升高(P＜0.05)，抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7基因HTR-8/SVneo和JAR细胞增值率明显下降(P＜0.05);3）过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞迁移距离明显增加（P＜0.05），抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞迁移距离明显减少(P＜0.05);4)过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞穿过人工基底膜的数量增加(P＜0.05)，抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后细胞穿膜数减少（P＜0.05）;过表达或抑制CXCL12、CXCR4和CXCR7后细胞凋亡数无改变增多（P＞0.05）。 结论：在体外细胞实验中，趋化因子CXCL12及受体CXCR4/CXCR7均参与了滋养细胞增殖、迁移侵袭的调控，因此CXCL12、CXCR4和CXCR7在胎盘植入绒毛过度侵袭中发挥着重要的作用。 第四部分 探讨趋化因子CXCL12和受体CXCR4/CXCR7影响滋养细胞侵袭能力的分子机制 目的：通过调控CXCL12、CXCR4和CXCR7基因水平，检测HTR-8/SVneo和JAR细胞RhoA、Rac1和Cdc42蛋白水平变化以及Rho/Rock、PI3K/AKT信号通路的活化情况，进一步探讨CXCL12、CXCR4和CXCR7影响滋养细胞侵袭能力的可能机制。 方法：1）应用Western blot检测沉默/过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后HTR-8/SVneo和JAR细胞RhoA、Rac1和Cdc42蛋白水平;2)Westernblot检测沉默/过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因后HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho/Rock、PI3K/AKT信号通路蛋白表达及磷酸化;3）在稳定过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7基因的HTR-8/SVneo和JAR细胞株中加入Rock抑制剂Y-27632或PI3K抑制剂NVP-BEZ235，Transwell侵袭试验检测细胞侵袭能力。 结果：1）沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7的表达水平可以抑制或上调HTR-8/SVneo和JAR细胞RhoA、Rac-1和Cdc42蛋白的表达;2)沉默或过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7的表达水平可以抑制或上调HTR-8/SVneo和JAR细胞Rho/rock通路上rock和磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)以及PI3K/AKT通路上磷酸化AKT蛋白表达;3）用Rho/Rock、PI3K/AKT信号通路抑制剂后，过表达CXCL12、CXCR4和CXCR7的HTR-8/SVneo和JAR细胞侵袭能力减弱。 结论：CXCL12、CXCR4和CXCR7通过调控下游Rho/rock、PI3K/AKT信号通路上MLC和AKT蛋白的磷酸化活化，以及下游蛋白RhoA、Rac1和Cdc42抑制或增强HTR-8/SVneo和JAR细胞的侵袭能力。

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