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影响广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变的全外显子多态性特征筛查及其功能鉴定

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摘要

第一部分 广西AFB1／HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变谱及临床预后分析

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 影响广西AFB1／HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变的全外显子多态性特征筛查

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 影响广西AFB1／HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变易感候选SNP位点的功能的初步验证

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

附录

综述

致谢

攻读学位期间发表论文

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摘要

本研究分为三个部分:1、广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变谱及临床预后分析;2、影响广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变的全外显子多态性特征筛查;3、影响广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变易感候选基因的功能的初步验证。
　　第一部分 广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变谱及临床预后分析
　　目的:调查广西地区各市AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变谱及临床预后分析
　　材材料与方法:收集2001年至2013年在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除术并经病理学诊断为原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的病例485例，所有患者血清乙肝表面抗原(HBV)均为阳性。Sanger测序法检测肝癌组织、部分配对癌旁组织及外周血TP53基因第249位密码子突变。绘制广西地区乙肝病毒相关性原发性肝细胞癌TP53基因第249位密码子突变地图，并结合当地1961年至2015年间满足黄曲霉菌产毒日比例，分析两者之间的关联性。将TP53基因第249位密码子突变与随访资料结合起来分析其对于预后的评价作用。单因素分析采用卡方检验和Cox风险比例模型，多因素分析采用Logistic回归与Cox风险比例模型。统计软件为SPSS18.0。P＜0.05认为达到统计学显著性。
　　结果:1、在本研究的485例病例中，我们发现一共有165(34.0％)例病例存在TP53基因第249位密码子突变，主要突变类型为:AGG＞AGT(Arg＞Ser)(159例，32.8％)与AGG＞AGC(Arg＞Ser)(6例，1.2％)。南宁地区突变率为34.7％，桂林地区是23.1％。2、，我们以产毒日占有效统计天数比例间接衡量黄曲霉毒素的暴露水平，并将其与当地HBV相关性HCC患者TP53基因第249位密码子突变率进行Spearman相关分析，结果显示并未发现两者间存在显著相关性（P=0.302，R=-0.297）。3、经倾向评分匹配(Propensity Score Matching，PSM)后，最后总计322例病例纳入临床预后分析，其中TP53基因第249位密码子突变组161例病例，TP53基因第249位密码子未突变组161病例。多因素Cox风险比例模型结果显示TP53基因第249位密码子未突变组与TP53基因第249位密码子突变组之间术后长期总生存和无瘤生存生存差异不显著(P＞0.05);但两组间2年内无瘤生存差异达到统计学显著性(P=0.039，HR=1.47，95％CI=1.02-2.18)，突变组患者术后2年内的复发风险相对更高。4、TP53基因第249位密码子突变与术前AFP水平联合分析结果显示在AFP水平＞400ng/mL+TP53基因第249位密码子突变组中患者术后临床预后相对较差，该组患2年内复发的风险(P=0.009，HR=1.90，95％CI=1.18-3.07)显著高于其他组。5、TP53基因第249位密码子突变与HBV相关性原发性肝细胞癌患者术后临床预后的分层分析结果提示在TP53基因第249位密码子突变分层患者中，根治性切除(P=0.165，HR=0.70，95％CI=0.42-1.16)、术后TACE治疗(P=0.083，HR=1.63，95％CI=0.94-2.83)、术后抗病毒治疗(P=0.851，HR=0.95，95％CI=0.56-1.62)并不能显著延长患者术后2年内的无瘤生存期，但根治性切除(P=0.012，HR=0.58，95％CI=0.38-0.89)、术后抗病毒治疗(P=0.022，HR=0.61，95％CI=0.40-0.93)能让TP53基因第249位密码子非突变分层患者获得更好的2年内无瘤生存。
　　结论:1、黄曲霉菌产毒日比例并不能有效和准确的反应黄曲霉毒素暴露程度。
　　2、TP53基因第249位密码子突变与HBV相关性HCC患者术后2年内复发存在显著关。
　　3、术前血清AFP水平＞400ng/mL+TP53基因第249位密码子突变亚组患者的临床预后更差。
　　4、在TP53基因第249位密码子突变分层患者中根治性切除、术后TACE治疗、术后抗病毒治疗并不能显著延长患者术后2年内的无瘤生存期。
　　第二部分 影响广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变的全外显子多态性特征筛查
　　目的:采用全基因组关联分析的策略，研究广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变的遗传易感性。
　　材材料与方法:1、收集2001年1月至2013年11月在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除术并经病理学诊断为原发性肝细胞癌的病例485例，所有患者血清乙肝表面抗原均为阳性。利用高通量的全外显子基因分型平台Illumina exome beadchip12v1对入组样本进行全外显子的单核苷酸多态性位点的分型。对于人群整体的质量控制我们采取以下几个方面实现:通过主成分分析来观察纳入人群是否存在分层;采纳芯片分型的样本的分型率＞95％的样本;采纳在芯片分析鉴定中，不存在模糊性别的个体;同源关系鉴定中采纳identity-by-descent＜0.1875的的群体（即不存在亲缘关系）。对候选位点的质量控制我们采信如下方案:剔除SNP分型成功率＜95％的位点;纳入符合哈迪温伯格平衡P＜1×10-6的位点;为了保证检验效能采纳最小等位基因频率大于0.05。2、收集2013年12月至2016年8月在广西医科大学第一附属医院肝胆外科行肝脏肿瘤切除术HBV相关性HCC患者手术标本270例。利用MassARRAY SNP基因分型平台对全基因组外显子扫描得出的候选SNP位点进行独立样本验证。3、芯片扫描阶段及独立样本重复验证阶段均采用EPACTS3.2.6软件包的Single Variant Test（选择Logistic Score Test模型）分析TP53基因第249位密码子突变与SNP之间的关联分性。卡方检验和logistic回归分析被用于分析基因遗传模型(Genetic model)与基因型之间的关系。连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)与重组模式(Recombination patterns)分析由LocusZoom软件包完成。
　　结果:1、经过质控后，总计459个样本，其中男性407例，女性52例;总计21501个SNP位点符合质控要求，总体成功分型率为98.35％。主成分分析的结果提示我们研究人群中并没有人群分层的存在(λ=1.008)。所有样本均不存在性别模糊和亲缘关系。由于样本量的限制，我们选择了最小等位基因频率大于0.05的单核苷酸多态性位点进行计算。芯片的分型结果的验证采用随机抽取10％样本直接测序的方法进行，结果示外显子芯片的分型和测序结果一致，结果可靠。通过计算，并没有位点在GWAS层面达到统计学显著性(P＜2×10-6，根据21501SNPs，α＜0.05)。但是我们将坐落在基因上的P值排在前30位的位点作为候选位点，进行独立样本验证。2、经过MassARRAY SNP基因分型平台质控后，总计258个样本，其中包含80例TP53基因第249密码子突变样本，178例TP53基因第249密码子未突变样本，29个候选SNP位点符合质控要求。独立样本验证结果显示rs8022091位点在TP53基因第249密码子突变组与未突变组之间等位基因分布频率差异达到统计学显著性(P=0.0232)。位于16号染色体ADAMTS18基因上的候选SNP位点rs9930984在两组人群中等等位基因频率的差异也达到显著性(P=0.0255)。3号染色体上的坐落于WDR49基因上的SNP位点rs75218075其基因频率的分布和TP53基因第249密码子突变也呈显著关联(P=0.0295)。3、两期数据合并后在矫正了年龄、性别、民族、吸烟状态、饮酒状态这些环境暴露因素后，rs8022091(P Combined=0.042)、rs9930984(P Combined=4.84×10-6)、rs75218075(P Combined=7.36×10-5)在TP53基因第249密码子突变组与未突变组之间等位基因分布频率依然呈现显著的差异，其中rs8022091在合并两期数据后差异显著性有所下降，而rs9930984、rs75218075在两组间的差异显著性显著增加。
　　结论:我们通过GWAS策略，初步对影响广西AFB1/HBV双暴露原发性肝细胞癌亚型TP53基因第249位密码子突变的全外显子多态性特征进行筛查，鉴定出rs9930984、rs75218075、rs8022091位点与TP53基因第249位密码子突变存在显著关联。

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