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微小RNA-206靶向缝隙连接蛋白43调控成骨分化在激素性股骨头坏死中的作用研究

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摘要

前言

第一部分 兔激素性股骨头坏死模型的建立及评价

1.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 试剂

1.1.3 仪器

1.2 方法

1.2.2 激素性股骨头坏死模型建立

1.2.3 核磁共振成像检查

1.2.4 组织病理学检查

1.2.5 股骨头坏死标准

1.2.6 统计学方法

1.3 结果

1.3.1 动物一般情况

1.3.2 MRI检查结果

1.3.3 组织病理学观察结果

1.4 讨论

第二部分 微小RNA-206及其靶蛋白Cx43调控成骨分化在激素性股骨头坏死中的作用

2.1 材料

1.1.1 实验动物

1.1.2 试剂

1.1.3 仪器设备及耗材

2.2 方法

2.2.1 碱性磷酸酶染色

2.2.2 免疫组织化学染色

2.2.3 原位杂交技术

2.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应技术

2.2.5 蛋白免疫印迹

2.2.6 统计学方法

2.3 结果

2.3.1 激素性股骨头坏死成骨分化障碍

2.3.2 激素性股骨头坏死miR-206表达增加

2.3.3 激素性股骨头坏死Cx43表达减少

2.3.4 激素性股骨头坏死Wnt信号通路关键分子表达情况

2.4 讨论

2.5 结论

参考文献

第三部分 综述 MicroRNA调控成骨分化的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

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摘要

研究背景及目的:激素性股骨头坏死(steroid-induced avascularnecrosis of the femoral head,SANFH)发病机制至今未明,成骨分化障碍与其密切相关。研究表明,微小RNA-206(microRNA-206,miR-206)可下调其靶蛋白缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)继而抑制成骨细胞分化,Cx43高表达可激活Wnt经典信号通路,促进成骨细胞分化。而miR-206靶向Cx43调控成骨分化在SANFH中的作用尚未见报道。我们假设Cx43/miR-206通过下游Wnt经典信号通路调控成骨细胞分化在SANFH中发挥重要作用。建立SANFH动物模型,动态检测股骨头内成骨分化相关因子、miR-206、Cx43及Wnt经典信号通路关键蛋白的表达变化,阐明miR-206靶向Cx43调控成骨分化在SANFH中的作用及潜在机制,为SANFH诊疗提供新靶点。
  方法:1、健康新西兰大白兔72只,雌雄各半,应用数字随机法分为模型组和对照组。模型组应用内毒素(lipopolysaccharide,LPS,10μg/kg)联合甲基强的松龙(methylprednisolone,MPS,20mg/kg)建立激素性股骨头坏死模型;对照组于相同时间注射等量生理盐水。两组动物分别于造模后第2、4和8周行核磁共振成像(magneticresonance imaging,MRI)检查,苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色确定模型成功建立。2、应用原位杂交(in situ hybridization,ISH)和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time-polymerase chainreaction,RT-PCR)检测兔股骨头内miR-206表达,RT-PCR和Western blot检测Cx43、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)、Dickkopf相关蛋白1(dickkopf-related protein1,Dkk1)、β-连环蛋白(β-catenin),免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测Cx43表达。
  结果:1、MRI检查显示模型组兔双侧股骨头T1WI信号强度降低,呈线样或斑点状,T2WI呈不均匀高信号;对照组兔双侧股骨头T1WI和T2WI未见异常信号。光镜观察显示模型组兔股骨头内骨小梁变细,甚至断裂,脂肪细胞增多增大,空骨馅窝增加;对照组兔股骨头内骨小梁结构完整,骨细胞清晰可见,空骨陷窝少见,脂肪细胞相对较少。模型组与对照组空骨陷窝率、脂肪细胞直径比较,差异均有统计学意义(p<0.05),模型成功建立。2、ALP染色显示ALP主要阳性表达于骨小梁边缘的成骨细胞,且模型组染色强度较对照组弱;RT-PCR结果显示模型组ALP和Runx2 mRNA表达量较正常组均降低(p<0.05),Westem blot结果表明Runx2蛋白在模型组兔股骨头内表达较对照组减少(p<0.05)。ISH结果显示miR-206阳性表达于髓腔、成骨细胞及少量骨细胞内,且模型组兔股骨头内着色较对照组强。RT-PCR结果表明模型组兔股骨头内miR-206表达较对照组增多(p<0.05),且随时间推移有上升趋势。ICH结果显示Cx43阳性表达于髓腔细胞及成骨细胞,且模型组兔股骨头内Cx43染色强度较对照组弱。RT-PCR和Western blot结果表明模型组兔股骨头内Cx43和β-catenin mRNA和蛋白均较对照组表达减少,而Dkk1蛋白和mRNA表达量较对照组明显增多(p<0.05)。
  结论:1、应用内毒素联合甲强龙可成功建立兔激素性股骨头坏死模型。2、成骨分化障碍与激素性股骨头坏死密切相关。3、miR-206可能通过下调其靶蛋白Cx43,抑制Wnt/β-catenin信号通路转导,进而抑制成骨分化参与激素性股骨头坏死发生发展进程。

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