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脂多糖诱导单核细胞炎症模型的优化及调补肺肾三法方药对NF-κB、STAT3通路活性的影响

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缩 略 词

前言

材料与方法

1 材 料

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1优化LPS诱导THP-1细胞炎症模型

2调补肺肾三法方药含药血清对 THP-1分泌细胞因子及 NF-кB、STAT3活性的影响

3调补肺肾三法含药血清对THP-1细胞NF-кB、STAT3表达的影响

讨论

1 中医学对COPD的认识

2 LPS诱导THP-1细胞炎症模型的优化

3 基于LPS炎症细胞模型的调补肺肾三法方药作用及其机制

结论

致谢

参考文献

附录

附录1 细胞照片

附录2 文献综述: COPD炎症相关分子的研究

附录3 在校期间论文著作和科研情况

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摘要

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是临床上一种具有气流受限特征的常见疾病，且其气流受限具有不完全可逆性，且呈现进行性发展的特征[1]。炎症反应是其重要的病理特征，因此展开对气道炎症反应的研究，对于阐明其发病机制尤为重要。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是细菌内毒素的主要成分,可以刺激组织细胞，通过释放出多种炎性物质（包括细胞因子等），诱导炎症反应[2]。炎症反应涉及到多种细胞和多个信号通路。其中巨噬细胞起到极为重要的作用，而各信号通路组成的分子网络系统对于其调节起到核心作用[3]。通过阻抑这些信号通路能够抑制COPD炎症反应，从而起到治疗的作用。本文通过研究LPS诱导人单核细胞系（THP-1细胞）分泌炎症因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1），及对信号通路核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB)、Janus激酶/信号转导-转录活化因子（JAK/STAT）、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)的激活情况，优化 LPS诱导 THP-1细胞体外炎症模型，研究调补肺肾三法（补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方）对其 IL-8、TNF-α，MMP-9分泌情况及对转录因子NF-κB、信号转导-转录活化因子3（Signal transducers and activators of transcription3，STAT3）的活性的影响。
　　目的：
　　观察LPS诱导THP-1细胞炎症模型的炎症因子及NF-κB、JAK/STAT、MAPK、PPAR信号通路中NF-κB、STAT3、核转录因子激活蛋白 AP-1(Nuclear factor activatorprotein-1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activa-ted receptorγ，PPARγ)活性的变化，筛选其靶通路，研究调补肺肾三法（补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方）对THP-1细胞NF-κB、STAT3转录因子的调控作用，以期为揭示调补肺肾三法方药抑制 COPD炎症反应的分子作用机制及其特点提供依据。
　　方法：
　　1.优化LPS诱导THP-1细胞炎症模型
　　阿尔玛蓝法测定 LPS对 THP-1细胞生长的影响，分2组。不同浓度 LPS（2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL）不同时间（6h、12h、24h、48h）对THP-1细胞生长的影响；不同浓度LPS（0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL）作用48h对THP-1细胞生长的影响。通过ELISA法检测1μg/mL、2μg/mL LPS在上述不同时间点作用后细胞上清中IL-6、IL-10、IL-8、TNF-α、MMP-9、TIMP-1等细胞因子的分泌情况，筛选出 LPS最佳浓度及最佳作用时间。凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)法检测1μg/mL LPS作用于THP-1细胞24h后转录因子（NF-κB、AP-1、PPARγ、STAT3）活化情况。
　　2.含药血清的制备
　　日本大耳白兔96只，随机分为：正常对照组、补肺益肾方组、补肺健脾方组、益气滋肾方组，分别灌喂给予生理盐水、补肺益肾方药、补肺健脾方药、益气滋肾方药，每日2次，于最7次给药后1h，通过腹主动脉采血，离心分离血清，过滤分装，56℃、30min灭活后-70℃保存备用。
　　3.观察调补肺肾三法方药对转录因子NF-κB、STAT3表达的影响
　　根据以上模型优化结果，分组干预细胞：空白血清组、模型组、补肺益肾组、补肺健脾组、益气滋肾组。每组血清分为20％、40%两个浓度，ELISA法检测细胞因子 IL-8、TNF-α、MMP-9。对于 NF-κB信号通路，添加抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）组；对于 JAK-STAT信号通路，添加抑制剂stattic组，EMSA法检测转录因子NF-κB、STAT3的活性。
　　结果：
　　1.LPS诱导THP-1细胞炎症模型
　　1.1、 LPS对THP-1细胞生长的影响
　　阿尔玛蓝法测定LPS对THP-1细胞生长的影响。10μg/mL LPS诱导6h还原率降低（p<0.05），2.5-40μg/mL各浓度LPS诱导12h、24h、48h还原率降低（p<0.05）。10μg/mL LPS在6h时及2.5-40μg/mL各浓度LPS在12h、24h、48h可使细胞质回缩，不饱满，细胞体积偏小，长势较慢。0.125-2μg/mL LPS作用48h对THP-1生长的影响无统计学意义。
　　1.2、 LPS对THP-1细胞分泌细胞因子IL-6、IL-10、IL-8、TNF-α、MMP-9、TIMP-1的影响
　　ELISA法检测1μg/mL、2μg/mL LPS作用THP-1细胞不同时间点（6h、12h、24h、48h）对细胞因子水平的影响。对于IL-6的影响：与正常对照组比较，1μg/mL、2μg/mL LPS在各个时间点IL-6分泌增多（p<0.01）；与12h同浓度的LPS比较，1μg/mL、2μg/mL LPS在24h、48h时分泌IL-6增多（p<0.01)；2μg/mL组比1μg/mL组在24h、48h时分泌IL-6减少（p<0.01）。对于IL-8的影响：与正常对照组比较，1μg/mL、2μg/mL LPS在12h时IL-8分泌减少（p<0.05），在24h、48h时IL-8分泌增多（p<0.05，p<0.01）；2μg/mL组在48h时比1μg/mL组时分泌 IL-8增多（p<0.05）。
　　对于 TNF-?的影响：与正常对照组比较，1μg/mL LPS在6h、48h时 TNF-?分泌增多（p<0.01），2μg/mL LPS在6h、12h、48h时TNF-?分泌增多（p<0.01）；2μg/mL组比1μg/mL组在6h、12h、48h时分泌TNF-?增多（p<0.01）。对于IL-10的影响：与正常对照组比较，1μg/mL LPS在6h时IL-10分泌增多（p<0.05），在24h IL-10分泌减少（p<0.05），2μg/mL LPS在各个时间点对IL-10的影响无统计学差异；2μg/mL组比1μg/mL组在6h、24h分泌IL-10减少（p<0.05）。
　　对于MMP-9的影响：与正常对照组比较，2μg/mL LPS在6h、48h时MMP-9分泌增多（p<0.01）；2μg/mL组比1μg/mL组在6h、48h分泌MMP-9增多（p<0.01）。对于TIMP-1的影响：与正常对照组比较，1μg/mL LPS在6h、48h时TIMP-1分泌减少（p<0.01），在12h时TIMP-1分泌增多（p<0.05），2μg/mL LPS在6h、12h TIMP-1分泌增多（p<0.01，p<0.05），在24h、48h TIMP-1分泌减少（p<0.01）；2μg/mL组比1μg/mL组在6h时 TIMP-1分泌增多（p<0.01），在24hTIMP-1分泌减少（p<0.01）。
　　1.3、 LPS对THP-1细胞转录因子NF-κB、STAT3、AP-1、PPARγ表达的影响
　　EMSA法检测1μg/mL LPS诱导THP-1细胞24h对转录因子NF-κB、STAT3、AP-1、PPARγ活性的影响。与正常对照组比较，1?g/mL LPS组 NF-кB、STAT3探针结合程度增多（p<0.01）；与正常对照组比较，1?g/mL LPS组对AP-1、PPARγ探针结合程度的变化无统计学意义。
　　2. THP-1细胞中NF-кB、STAT3调控的调补肺肾三法含药血清对炎症反应机制的影响
　　2.1、调补肺肾三法不同浓度含药血清对THP-1细胞生长的影响
　　通过阿尔玛蓝法测定不同浓度含药血清对于 THP-1细胞生长的影响。与20%空白血清组比较，20%补肺益肾组还原率明显增高（p<0.05），20%补肺健脾组、益气滋肾组还原率明显增高（p<0.01）；与20%模型组比较，20%补肺健脾组、20%益气滋肾组还原率明显增高（p<0.01）；与40%模型组比较，40%补肺健脾组还原率明显降低（p<0.05），余浓度含药血清还原率无明显统计学意义。
　　2.2、调补肺肾三法含药血清对 THP-1细胞分泌IL-8、TNF-?、MMP-9的影响
　　ELISA法检测调补肺肾三法（补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方）20%及40%含药血清对 THP-1细胞分泌 IL-8、TNF-?、MMP-9的影响。与20%空白血清组比较，20%模型组 MMP-9、TNF-?分泌增多（p<0.01，p<0.05），20%100mmol/L stattic组MMP-9、IL-8的分泌减少（p<0.01），20%100mmol/L PD TC组 IL-8分泌减少（p<0.01）；与20%模型组比较，20%100mmol/L stattic组MMP-9、IL-8、TNF-?分泌减少（p<0.01），20%100mmol/L PDTC组IL-8分泌减少（p<0.01）。20%调补肺肾三法方药对MMP-9、TNF-?的分泌有减少的趋势，但没有明显的统计学差异。
　　与40%空白血清组比较，40%模型组MMP-9、IL-8、TNF-?分泌增多（p<0.01），40%益气滋肾组TNF-?分泌减少（p<0.01），40%100mmol/L stattic组、40%100m mol/L PDTC组MMP-9、IL-8分泌减少（p<0.01），TNF-?的分泌减少（p<0.05）；与40%模型组比较，40%含药血清（补肺健脾、补肺益肾、益气滋肾）MMP-9分泌减少（p<0.05），IL-8、TNF-?的分泌减少（p<0.01），100mmol/L stattic组、100mmol/L PDTC组MMP-9、IL-8分泌减少（p<0.01)，TNF-?的分泌减少（p<0.05）。
　　2.3、调补肺肾三法含药血清药及抑制剂对 THP-1细胞 NF-кB、STAT3转录因子活性的影响
　　EMSA法检测调补肺肾三法方药及抑制剂，20%、40%浓度含药血清各组对NF-кB、STAT3活性的影响。对于转录因子NF-кB的活性：与40%空白血清组比较，40%模型组与NF-кB探针结合程度增多（p<0.01）；与40%模型组比较，40%调补肺肾三法（补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方）及抑制剂 PDTC组与 NF-кB探针结合程度减少（p<0.01）；与20%空白血清组比较，20%调补肺肾三法含药血清与NF-кB探针结合程度有增多的趋势，但无明显统计学意义；与20%模型组比较，亦无明显统计学意义。
　　对于转录因子STAT3的活性：与40%空白血清组比较，40%模型组与STAT3探针结合程度增多（p<0.01）；与40%模型组比较，40%调补肺肾三法含药血清组及抑制剂stattic组与STAT3探针结合程度减少（p<0.01）；与20%空白血清组比较，20%模型组与 STAT3探针结合程度有增多的趋势，但无明显统计学意义；与20%模型组比较，20%调补肺肾三法含药血清组及抑制剂stattic组无明显统计学意义。
　　结论：
　　1.1、μg/mL LPS作用THP-1细胞24h能激活NF-кB、JAK-STAT通路的活性。优化细胞炎症模型的条件，选用1?g/mL诱导THP-1细胞24h来建立炎症模型是适宜的。
　　2.调补肺肾三法（补肺健脾方、补肺益肾方、益气滋肾方）均能下调模型组细胞分泌炎症因子IL-8、TNF-?、MMP-9的水平，抑制NF-κB、STAT3转录因子的活性。

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