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mir-574-5p在宫颈鳞癌中的表达差异及其对SiHa细胞的生物学功能影响

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第一章 miR-574-5p在宫颈鳞癌患者血清及组织中的表达情况

1 实验材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 miR-574-5p对宫颈鳞癌SiHa细胞生物学行为的影响

1 实验材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第三章 miR-574-5p靶基因的预测与验证

1 靶基因的预测

2 实验材料与方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

第四章 综述

致谢

攻读硕士学位期间完成的论文

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摘要

研究目的：
　　宫颈癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤，每年造成约三十万余患者死亡，其中约85％病理类型为宫颈鳞状细胞癌。临床工作中宫颈癌筛查方式的普及促进了宫颈癌早期发现、早期治疗，但宫颈癌的发病率仍居高不下并出现逐年年轻化的趋势。浸润、转移是恶性肿瘤迅速进展的两个重要因素，临床研究表明发生转移的宫颈癌患者预后较差。因此，探索宫颈癌的发生发展机制对于临床中有效治疗宫颈癌有重要意义。MicroRNAs（miRNAs）是大小约19-22个核苷酸的高度保守非编码小RNAs，其通过转录或转录后水平降解靶基因的表达参与信号通路的调控，促进或抑制了肿瘤的发生、发展。本课题组前期研究发现miR-574-5p在宫颈鳞癌患者中呈高表达水平，提示其在宫颈癌的发生发展中起着促进的作用。
　　本研究拟通过血清及组织标本验证宫颈鳞癌患者与良性肿瘤患者血清及组织中miR-574-5p的表达水平，探讨两者中miR-574-5p的表达差异及其与临床病理特征（临床分期、病理分级、肿瘤大小、淋巴结转移等）的关系;并通过转染miR-574-5p mimics及inhibitor上调或下调宫颈鳞癌SiHa细胞中miR-574-5p的表达水平，采用细胞生物学功能试验观察SiHa细胞在凋亡和周期、增殖、侵袭和迁移的变化，探讨miR-574-5p对SiHa细胞生物学特性的影响;最后利用生物信息学靶基因预测软件寻找其可能作用靶点，通过实时荧光定量PCR及Western-blot实验分别在转录及翻译水平检测miR-574-5p的靶基因表达水平。本研究通过上述方法阐明上调及下调miR-574-5p的表达水平在宫颈鳞癌发生、发展中的分子作用机制，为临床中更有效的治疗宫颈癌提供一种新的思路及方法。
　　研究方法：
　　(1)收集2011年3月～2013年4月在广西医科大学附属肿瘤医院住院治疗的80例宫颈癌患者作为研究对象，其中80例宫颈癌组织通过手术中切除或活检并经病理证实获取;并选择同期住院期间患良性病变（子宫肌瘤行全子宫切除术）的80例患者血清及组织作为正常对照组，组织/血清标本的采集均在初次治疗前进行。采用实时荧光定量PCR技术验证组织/血清标本中miR-574-5p的表达差异;运用Spearman秩相关分析血清及组织中miR-574-5p表达水平与宫颈鳞癌临床病理因素之间的关系。
　　(2)培养宫颈鳞癌SiHa细胞株，采用瞬转方法转入人工合成的miR-574-5pmimics、miR-574-5p inhibitor及miR-Negative Control(miR-NC)，并根据实验目的将转染成功后的SiHa细胞分为以上三组及空白对照组共四组。采用实时荧光定量PCR检测转染后SiHa细胞中miR-574-5p的表达水平以验证是否转染成功;通过CCK-8细胞增殖实验及平板克隆实验检测细胞生长增殖能力、Transwell迁移及侵袭实验检测细胞的转移及浸润能力、流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。
　　(3)利用生物信息学技术预测miR-574-5p作用靶点，并通过实时荧光定量PCR技术及Western-blot实验分别在转录及翻译水平验证靶基因的准确与否，进一步明确miR-574-5p促进宫颈癌发生发展的分子机制。
　　研究结果：
　　(1)宫颈鳞癌患者血清及组织中miR-574-5p相对表达量均高于正常对照组，差异有统计学差异(P＜0.001);通过Spearman秩相关统计学分析方法发现血清及组织中miR-574-5p相对表达量与宫颈鳞癌的临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小及病理分级有关，差异具有统计学意义(P＜0.05);相反的，miR-574-5p的表达量与年龄及绝经与否无明显统计学差异(P＞0.05)。
　　(2)实时荧光定量PCR检测证实瞬转miR-574-5p mimics后宫颈癌SiHa细胞中miR-574-5p明显上调(P＜0.05)，而转染miR-574-5p inhibitor后miR-574-5p显著下调（P＜0.05），说明采用lipo2000瞬转成功，后续实验结果可靠。
　　(3)细胞生物学功能实验:CCK-8细胞增殖实验及平板克隆实验结果显示转染miR-574-5p mimics后SiHa细胞的增殖能力较其他三组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，而转染miR-574-5p inhibitor的SiHa细胞组的增殖能力较其他三组细胞明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05);Transwell迁移侵袭实验结果提示转染miR-574-5p mimics后侵袭及迁移能力明显增强(P＜0.05)，转染miR-574-5p inhibitor后明显抑制SiHa细胞的迁移及侵袭能力(P＜0.05);流式细胞仪检测细胞凋亡实验结果显示miR-574-5pmimics组SiHa细胞凋亡数明显低于另外两组(P＜0.05)，miR-574-5p inhibitor组SiHa细胞的凋亡细胞数则较另两组细胞明显升高(P＜0.05);而细胞周期则无明显改变。
　　(4) miR-574-5p的作用靶点的预测及验证:经过检索数据库选择FOXO3为其靶基因，实时荧光定量PCR技术及Western-blot实验检测发现miR-574-5p mimics中FOXO3基因及FOXO3蛋白的表达量均较另三组升高，而转染了miR-575-5p inhibitor则明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　研究结论：
　　MiR-574-5p在宫颈鳞癌患者血清及组织中均呈高表达水平，且随着患者肿瘤分化程度降低、临床分期级别增加、肿瘤直径增大及淋巴结转移其相对表达量逐渐上升，说明其对宫颈癌的发生发展有一定的促进作用，为进一步的研究提供了实验基础。瞬转后通过生物细胞功能学实验观察发现miR-574-5p促进宫颈癌SiHa细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制细胞的凋亡。MiR-574-5p促进宫颈癌的进展分子机制可能是其通过其抑制靶蛋白FOXO3的表达而实现。

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