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牛肺炎支原体分离鉴定及主要基因分子特征研究

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文献综述:牛支原体研究进展

1 牛支原体的形态特征及培养特征

2 牛支原体的检测方法

3 牛支原体vsp家族

4牛支原体肺炎的流行病学特征

5牛支原体与其他病原体的协同感染

6牛支原体肺炎的综合防控

7 结语

第一章 牛支原体快速检测方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 牛支原体贵州流行株的分离鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 牛支原体贵州株GZ-2全基因测序

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 牛支原体贵州株主要功能基因分子特征分析

１ 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文结论

参考文献

附录一 牛支原体生化鉴定配制

附录二 文章发表情况

致谢

声明

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摘要

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis)是引发牛支原体肺炎的病原，主要引起犊牛肺炎、成年牛乳房炎，也可引起关节炎、结膜角膜炎、中耳炎、生殖道炎症等。2008年，国内多省市相继爆发了肺炎为主要症状的牛支原体疫病，贵州省也有疑似病例发生，但缺乏病原地方流行株分离及生物学特征的研究资料，给本病的诊断与防控带来困难。本文根据牛支原体肺炎血清流行病学调查资料，筛选获得阳性病例样本，开展病原快速诊断方法、病原生物学特征和病原基因组特征研究，为探讨牛支原体贵州流行株的致病机理提供基础研究资料，为牛支原体肺炎诊断、预防与控制方案制定储备病原学研究资料。
　　1.牛支原体快速检测方法的建立：为实现牛支原体肺炎临床病例的快速诊断、阳性组织材料的快速筛选和病原含量的定量分析，本研究基于牛支原体TU基因序列设计合成特异性引物，建立牛支原体普通PCR检测方法和TaqMan实时荧光定量PCR方法，并优化PCR反应体系、反应条件和评估所建立牛支原体PCR检测方法可靠性。结果显示以牛支原体国际标准株（PG45）DNA样本为模板，本研究所建立的普通PCR方法能扩增TU基因大小为752bp片段，与预期大小相符；最佳退火温度为60℃。该方法能有效区分丝状支原体山羊亚种和牛支原体，具有较好的特异性和临床应用性；所建立方法DNA最小检出浓度为1.034×10-6 g/L，敏感性良好。以牛支原体DNA样本制备标准质粒样品，基于TU基因设计并合成的特异性引物及探针建立Taqman实时荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线的斜率为-3.24，截距为46.20，相关系数为-0.996。所建方法的性能评价显示，所建立Taqman实时荧光定量PCR检测方法能区分丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、巴氏杆菌等和牛支原体，最小检出浓度为1.91×101copies/μL。证实该方法具有良好的特异性和灵敏度。
　　2.牛支原体贵州株的分离鉴定：应用ELISA技术对9地区（市）的1074份血清样本进行血清抗体检测，根据检测结果进筛查阳性感染病例，观察病例剖检病变，采集阳性组织材料。应用支原体实验室培养技术对牛支原体贵州株进行分离与培养，采用形态学、生物化学、分子生物学方法对牛支原体分离株进行鉴定。结果可见，9地区的1074份样本中阳性样本数为14，占1.03%；其中安顺地区样本阳性率较高，为4.65%。牛支原体临床病例主要表现为身体消瘦、患病牛只精神沉郁、鼻腔流血、流涎、眼眶有渗出物、并患有关节炎症状。对采集自安顺和黔南两地的阳性材料进行牛支原体PCR检测可扩增出752bp的目的基因扩增。阳性病例肺脏样本经匀浆及除菌处理后接种入Broth支原体培养基中，经连续传代可见，接种36-48h后培养基颜色变化，牛支原体固体培养可见典型的“煎蛋”状菌落；对牛支原体分离培养物应用普通显微镜和电子显微镜进行形态学观察可见菌体姬姆萨染色显蓝紫色，形态以不规则丝状为主，呈多形性；电镜观察结果显示牛支原体菌体呈球状；生物化学鉴定可见分离菌株能消化磷酸酶，对毛地黄皂苷敏感；但是不能发酵葡萄糖、水解精氨酸，尿素、不能分解七叶苷，杨梅苷、对氯化四氮唑没有还原性。病原学核酸检测可见两株支原体分离株均为牛支原体，核酸序列分析显示，牛支原体贵州分离株与牛支原体标准株的OPPD/F基因相似度达到了99%以上。两株牛支原体分离株分别命名为Mycoplasma bovis-GZ1，Mycoplasma bovis-GZ2。
　　3.牛支原体贵州株GZ-2全基因测序：收集牛支原体Mycoplasma bovis GZ-2株培养物，提取总DNA基因组材料，采用诺禾致源基因生物工程公司小基因组测序技术对总DNA样本进行测序。采用SOAP denovo2.04对基因进行组装，通过kmer分析及GC-depth分析评价组装结果。结果显示，GC-depth散点图呈现泊松分布的形状，所以说明该测序数据不存在GC的偏向性。该分离株全基因组序列测序结果表明其基因组大小为934，881 bp，编码区为655，149 bp，占基因组的比率为70.08%，GC%为30.01%。其中非编码区总长度为279，732 bp，GC%含量为27.7%，占整个基因组总长度29.92%。串联重复序列有67个，总长为5807 bp，占基因组全场的比率为0.6211%。小卫星序列53个，微卫星序列5个。通过对分离培养的牛支原体贵州株进行NR数据库分析，在616个基因中510个基因与牛支原体同源。应用COG、KEGG及GO基因数据库对测定的牛支原体贵州株GZ2基因功能进行分析，本株牛支原体碳源的相关通路相对完整，用甘油代替糖类作为其碳源。测序结果显示，牛支原体还具有7个免疫相关蛋白及4个vsp家族蛋白。
　　4.牛支原体贵州株主要功能基因分子特征分析：运用GenBank中的Blast及DNA Star、Mega5.0软件、ExPASY软件、IMED软件等分析软件对牛支原体贵州株GZ-2基因组中3个vsp家族蛋白基因、3个防御相关蛋白基因及3个粘附相关蛋白基因进行分子特征分析。结果可见，vsp家族蛋白基因高度保守，不同牛支原体分离株3个vsp家族基因的同源性均为100%，高度保守。通过预测发现，牛支原体贵州株GZ-2 vspY蛋白可能含有7个抗原表位，其中第20-31位氨基酸为抗原指数高的优势抗原表位。牛支原体贵州株GZ-2 vspC基因与牛支原体的标准株PG45的vsp家族基因中有22段重复序列，vspC蛋白可能含有2个抗原表位，其中由第4-25位氨基酸抗原指数高的优势抗原表位。假定vsp蛋白可能含有4个抗原表位，其中由第13-37位氨基酸抗原指数高的优势抗原表位。防御相关蛋白多抗药性ABC转运ATP结合蛋白、I型限制修饰系统甲基转移酶亚基基因的蛋白不同牛支原体分离株同源性均为100%，而牛支原体贵州株GZ-2与牛支原体PG45株噬菌体顿挫感染蛋白基因同源性为99.9%，牛支原体贵州株GZ-2株与牛支原体标准株PG45相比在碱基排列的第47位发生了突变，并且造成了氨基酸突变,由异亮氨酸变为了谷氨酰氨。
　　粘附相关蛋白分析结果显示，两株牛支原体贵州分离株GZ1和GZ2 P81基因同源性为100%，与其他地方分离株的核苷酸序列同源性在92.1%~97.4%，与标准株PG45的核苷酸序列同源性为92.1%，存在多位点变异。基于P81基因系统发生树分析显示，牛支原体贵州分离株与国内分离株进化关系近，而与PG45存在一定的进化距离。抗原性分析显示P81蛋白可能含有28个抗原表位，其中第560-602位氨基酸为抗原指数高的优势抗原表位。牛支原体贵州株GZ1的TU基因与PG45标准株的同源性为99.1%， GZ2的同源性为99.9%，国内湖北、重庆、内蒙古分离株与标准株的同源性介于99.2-99.4%之间。从进化树分析可知GZ1与国内湖北、重庆、内蒙古的分离株位于同一分支，而GZ2与PG45位于同在一个分支。TU基因蛋白可能含有14个抗原表位，其中由第101-108位氨基酸为抗原指数高的优势抗原表位。P48基因在两株贵州株的同源性仅为99%，GZ1、GZ-2株与牛支原体标准株PG45的同源性分别为99.6%和99.9%。而与国内其他分离株的同源性为99.6%和99.9%。牛支原体贵州株GZ1与PG45位于同一分支，而与牛支原体GZ2及其他国内分离株位于不同分支。P48基因蛋白可能含有15个抗原表位，平均抗原趋向性为1.0220。其中由第4-27位氨基酸为抗原指数高的优势抗原表位。

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