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施用KMM复合微生物菌肥对苹果连作障碍的生态效应研究

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摘要

1引言

1．1 苹果连作障碍的研究进展

1．1．1 苹果连作障碍的病因

1．1．2 苹果连作障碍的防治

1．1．3 生物防治在防治苹果连作障碍中的研究与应用

1．2 有机肥对土壤生态效应的影响

1．3 高通量测序技术在微生物学研究中的应用

1．4 本研究的背景及目的意义

2．1．1 供试果园

2．1．2 供试种子和菌株

2．1．3 供试肥料与试剂

2．1．4 供试培养基

2．1．5 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 施肥方案及土样采集

2．2．2 果树长势测定

2．2．3 土壤理化因子的测定

2．2．4 土壤酶活性的测定

2．2．5 Illumina MiSeq测序过程

2．2．6 KMM复合微生物菌肥中可培养微生物的分离和纯化

2．2．7 KMM复合微生物菌肥中有效菌株的筛选

2．2．8 盆栽试验测定组合菌株对海棠苗的防病促生作用

2．2．9 拮抗菌株的种类鉴定

2．2．1 0数据分析

3结果与分析

3．1 KMM复合微生物菌肥处理对连作苹果植株长势的影响

3．2 KMM复合微生物菌肥处理对根际土壤理化因子的影响

3．3 KMM复合微生物菌肥处理对根际土壤酶活性的影响

3．4 土壤微生物群落的变化

3．4．1 土壤微生物总DNA的提取

3．4．2 ITS rDNA和16S rRNA基因序列测序深度分析

3．4．3 不同分类水平的微生物类群数

3．4．4 ITS rDNA和16S rRNA主成分分析

3．4．5 土壤微生物群落结构

3．4．6 样本组间分类学组成的差异分析

3．5 KMM复合微生物菌肥中有效拮抗菌株的测试

3．5．1 平板对峙法测定菌株对病原菌的抑制作用

3．5．2 种子萌发法测定菌株对海棠种子萌发的作用

3．5．3 盆栽试验测定菌株对海棠苗的促生作用

3．6 菌株组合对海棠苗的促生作用

3．7 组合菌株的鉴定

3．7．1 形态学鉴定结果

3．7．2 生理生化鉴定结果

3．7．3 分子生物学鉴定结果

4讨论

4．3 施用KMM复合微生物菌肥后土壤真菌群落的变化

4．4 施用KMM复合微生物菌肥后土壤细菌群落的变化

4．5 KMM复合微生物菌肥中有效拮抗菌株的组合

5结论

参考文献

作者简介

致谢

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摘要

近年来，苹果连作障碍（Apple Replant Disorder，ARD）已成为老果园重建的限制因素。在前期研究中，本研究室已通过田间试验证实了KMM复合微生物菌肥可以显著缓解苹果连作障碍，但该菌肥的作用机理尚不清楚，推测KMM复合微生物菌肥可以通过改变根际土壤生态效应提高果树连作成活率。本研究通过土壤常规农业化学分析法和Illumma MiSeq高通量测序技术，系统研究了施用菌肥后连作苹果根际土壤的理化因子、酶活性以及微生物群落结构的变化，从而综合反映KMM复合微生物菌肥对连作苹果根际土壤的生态效应;此外，通过室内对峙试验和盆栽试验对从菌肥中筛选的单株拮抗微生物以及复配拮抗菌株的组合进行了综合分析，为进一步优化菌肥奠定基础。主要研究结果如下:
　　1、KMM复合微生物菌肥处理与有机肥(CK)处理相比，植株的株高增长率、干径增长率、叶绿素含量、分枝个数和分枝长度分别显著提高到对照处理的1.27、1.28、1.13、1.19和1.24倍，该结果表明KMM复合微生物菌肥比普通有机肥对连作苹果幼苗的生长有更明显的促进作用。
　　2、与有机肥处理的土壤相比，KMM复合微生物菌肥处理的土壤中，碱解氮、速效钾和速效磷含量均无显著差异，而有机质含量则由9.51g/kg显著提高到15.88g/kg，这一结果表明KMM复合微生物菌肥对土壤理化性质的改良是通过提高有机质的含量而非提高矿质元素的含量。
　　3、与有机肥处理的土壤相比，KMM复合微生物菌肥处理的土壤中，中性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶的活性分别显著提高了1.28、1.34、2.50和2.00倍。这说明施用KMM复合微生物菌肥对于提高根际土壤中酶的生物活性具有重要作用，这可能与土壤中微生物群落多样性的变化有关。
　　4、与有机肥处理的土壤相比，KMM复合微生物菌肥处理的土壤中，真菌的微生物群落发生了明显的变化。在门水平上，所测得真菌种群主要门类一致且排序相同，但相对丰度有所变化。其中，接合菌门(Zygomycota)的相对丰度由2.08％下降至1.02％，产生显著差异。在属水平上，链格孢属(Alternaria)、赤霉菌属（Gibberella）、镰孢菌属（Fusarium）、短梗霉属(Aureobasidium)的相对丰度排名分别上升3位、4位、4位和5位，而腐质霉属（Humicola）的相对丰度排名下降了3位。相对丰度变化显著的是链格孢属、赤霉菌属和寄生性子囊菌属（Phaeoacremonium），分别上升1.95％、3.25％和2.07％。仅在KMM处理中位于前20，且相对丰度产生显著差异的有刺盘孢属（Colletotrichum）和金孢子菌属（Chrysosporium），分别为2.71％和1.49％，其他真菌菌属无显著差异。
　　5、与有机肥处理的土壤相比，KMM复合微生物菌肥处理的土壤中，细菌的微生物群落发生了更加明显的变化。所测得细菌种群主要门类一致（相对丰度＞1％），但排序无显著差异，相对丰度变化最显著的是厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。厚壁菌门的相对丰度由22.97％降低为14.91％，蓝藻菌门的相对丰度由2.81％降低为1.44％，而芽单胞菌门相对丰度则由6.92％提高到12.25％。在属水平上，排序变化明显的菌属是乳球菌（Lactococcus）、海洋杆菌属（Oceanobacillus）、芽单胞菌（Gemmatimonas）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）和马赛菌（Massilia），前2者次序分别下降9位和7位，而后3者则分别上升5位、4位和6位。相对丰度变化显著的菌属是芽胞杆菌属（Bacillus）、伯克氏菌属（Burkholderia）、乳球菌属和罗丹杆菌属（Rhodanobacter），前两者分别上升5.52％和6.64％，后两者分别下降了5.20％和1.94％。仅在KMM处理中位于前20，且相对丰度产生显著差异的是假单胞菌属（Pseudomonas），相对丰度达到了1.76％，产生显著差异，其他细菌菌属无显著差异。
　　6、从KMM复合微生物菌肥中共分离获得51个分离物。通过平板对峙和种子萌发试验筛选出6个分离物对尖孢镰刀菌有明显抑菌作用且能促进种子萌发，菌株编号分别为KMM-12、KMM-15、KMM-37、KMM-39、KMM-48和KMM-50。盆栽实验显示，KMM-15、KMM-37和KMM-50菌株处理后，株高增长率分别显著提高了52.33％、47.76％和50.19％，茎粗增长率分别显著提高了44.78％、35.24％和34.07％，叶绿素增长率显著提高了20.61％、8.47％和21.36％，3个菌株单株处理获得的指标均显著高于KMM处理和CK处理的指标（除菌株KMM-37的叶绿素增长率）。将3株促生效果明显的菌株行组合，发现促进株高生长最显著的组合为KMM-15和KMM-37，组合比例为1∶2.5，株高增长率达到了75.20％;促进茎粗生长最显著为组合为KMM-15和KMM-50，组合比例为1∶2.5，茎粗增长率达到了33.21％;叶绿素增加最显著的组合为KMM-37和KMM-50，组合比例为5∶1，叶绿素增长率达到了16.27％。综合株高、茎粗和叶绿素三项生长指标，本试验发现，组合后的菌株KMM-15和KMM-37对海棠苗的促生作用最显著，最佳组合体积比为1∶2.5。

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