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【6h】

环介导等温扩增技术对水产养殖鱼类常见病毒的快速检测

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摘要

1.1研究背景概述

1.2鱼类病毒性疾病检测技术研究现状

1.2.1传统检测技术

1.2.2免疫学检测技术

1.2.3聚合酶链式反应

1.2.4环介导等温扩增技术

1.3研究目的及意义

1.4主要研究内容及技术路线

2环介导等温扩增对鲤春病毒血症病毒的快速检测

2.1材料与方法

2.1.1试剂与仪器

2.1.2引物的设计

2.1.3 LAMP参数的优化

2.1.4 LAMP反应体系

2.1.5 LAMP产物检测分析

2.1.6基于三种终端检测方法的SVCV-LAMP的特异性评价

2.2.1 LAMP引物设计

2.2.2 LAMP参数的优化

2.2.3基于三种终端检测方法的SVCV-LAMP的特异性分析

2.2.4基于三种终端检测方法的SVCV-LAMP的灵敏度分析

2.3讨论

2.4小结

3环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测草鱼呼肠孤病毒

3.1材料与方法

3.1.1试剂

3.1.2引物的设计

3.1.3 LAMP反应

3.1.4 qPCR反应

3.1.5 LAMP产物的LFD检测

3.1.6 LAMP-LFD及qPCR特异性评价

3.1.7 LAMP-LFD及qPCR灵敏度评价

3.2结果与分析

3.2.1 LAMP扩增条件的确定

3.2.2 LAMP-LFD与qPCR特异性分析

3.2.3 LAMP-LFD与qPCR灵敏度分析

3.3讨论

3.4小结

4环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测鲤疱疹病毒Ⅲ型

4.1材料与方法

4.1.1试剂

4.1.2引物的设计

4.1.3 LAMP反应

4.1.4 qPCR反应

4.1.5 LAMP产物的LFD检测

4.2.1 LAMP扩增条件的确定

4.2.2 LAMP,LAMP-LFD与qPCR特异性分析

4.2.3 LAMP,LAMP-LFD与qPCR灵敏度分析

4.3讨论

4.4小结

5结论

参考文献

附录

硕士期间发表论文

作者简介

致谢

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摘要

本研究针对鱼类病毒检测中目前亟待解决的问题以及产业发展需求,以鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)、草鱼呼肠孤病毒(Grass carp virus,GCRV)及鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus-Ⅲ,CyHV-Ⅲ)为研究对象,基于其保守基因序列,设计引物,优化LAMP反应体系,探讨了LAMP反应产物在不同终端检测方法下的灵敏度及特异性;将优选的检测方法与实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)进行对比评价;另以2套引物进行LAMP反应,通过优化反应体系,对反应时间、特异性、灵敏度等方面与单套引物LAMP联合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)检测技术(LAMP-LFD)进行对比,以期为鱼类病毒快速检测提供一定的理论基础和技术指导。主要研究结果分述如下:
  1.鲤春病毒血症病毒LAMP扩增产物三种终端检测方法的对比研究
  鲤春病毒血症病毒(SVCV)是一种重要的鲤科鱼类致病病毒,属弹状病毒科(Rhabdoviridae),水疱疹病毒属(Vesiculovirus),其可导致鲤鱼(Cyprinus carpio)出血性症状且具有高度传染性。本研究开发了一种LAMP体系,通过结合不同的终端检测方法,实现对SVCV的现场快速检测。以SVCV的糖蛋白(Glycoprotein,G)基因为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),并对LAMP方法的反应参数进行优化,应用SYBR GreenⅠ,LFD和琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis,AGE)三种终端检测方法对LAMP产物进行检测。将上游内引物FIP以生物素(Biotin,BIO)标记,同时设计1条羟基荧光素(Fluorescein amidite,FAM)标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果显示:LAMP最佳反应体系为8mmol/L Mg2+,320U/mL Bst DNA聚合酶,1.4mmol/L dNTP,1mol/L Betaine,最佳反应温度为63℃,最佳反应时间为40min。本研究中,SVCV的LAMP-LFD体系最低检测限为860fg,与SYBR GreenⅠ检测灵敏度相同,AGE检测最低检测限为86fg,且3种检测方法均未与其他常见鱼类病毒发生交叉反应。在三种终端检测方法中,LAMP-LFD摆脱了对实验室条件的依赖,且不易出现假阳性现象,较SYBR GreenⅠ及AGE方法更适宜于现场检测,此外,本方法为基于PCR技术的检测提供了有效替代方法。
  2.草鱼呼肠孤病毒LAMP-LFD检测方法的建立
  草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株,本研究建立了一种GCRV的LAMP-LFD快速检测方法,并与qPCR技术进行了对比。以GCRV的S8片段为检测靶标,设计6条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3,LF/LB),其中上游引物FIP以BIO标记,进行LAMP反应条件优化,同时设计1条FAM标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间为40min。从LAMP扩增到LFD结果判读共需50min,与qPCR检测相比时间缩短近1h。LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出GCRV,针对GCRV同一重组质粒的检测,LAMP-LFD的检测限为970fg,qPCR的检测限为97fg,虽然本研究所建立的GCRV的LAMP-LFD检测体系的灵敏度低于qPCR10倍,但LAMP-LFD操作简单,无需特殊仪器设备,可快速、特异地检测出GCRV,有望成为GCRV现场快速检测的常规技术手段。
  3.鲤疱疹病毒Ⅲ型LAMP-LFD技术的建立
  锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease,KHVD)因具有高度传染性、致死性而被广泛关注,鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpes virus-Ⅲ,CyHV-Ⅲ)是引发该病的主要病原。本研究将LAMP-LFD应用于快速检测CyHV-Ⅲ,并与qPCR技术进行对比。以CyHV-Ⅲ的胸苷激酶(Thymidine kinase,TK)基因为检测靶标,设计3套4条特异性引物(FIP/BIP,F3/B3),通过对3套引物扩增效果对比,选取实验引物,并设计该套引物配套环引物(LF/LB),其中上游引物FIP以BIO标记,并进行LAMP反应条件优化,同时设计1条FAM标记的探针,用于LAMP反应产物的LFD检测。结果表明:单套引物LAMP最佳反应温度为63℃,反应时间40min,2套引物LAMP最佳反应温度为61℃,反应时间30min,且反应进行20min时即可检测到反应产物,比qPCR检测时间缩短近1h。LAMP、LAMP-LFD与qPCR均可特异性检出CyHV-Ⅲ,针对同一重组质粒的检测,单套引物LAMP-LFD的检测限为32.6fg,qPCR的检测限为32.6fg,2套引物LAMP检测限为3.26fg。在本研究中,因选取的2套引物设计位点所限,未能进行2套引物LAMP-LFD检测,而以AGE检测代替。本研究所建立的CyHV-Ⅲ的2套引物LAMP反应速度快,灵敏度高,可特异地检测出CyHV-Ⅲ,有望成为CyHV-Ⅲ现场快速检测的常规技术手段。
  综上所述,本研究建立了水产养殖鱼类常见病毒的LAMP-LFD检测体系,通过对反应组分及反应条件的优化,筛选了最佳反应体系,并成功应用于对SVCV,GCRV及CyHV-Ⅲ的检测。LAMP-LFD体系的建立,对水产病毒的现场快速检测,及病毒性疾病的防控具有重要意义。

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