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多基因植物转化载体的构建以及对烟草的遗传转化

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论文说明

摘要

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1 引言

1．1 植物表达载体的构建

1．1．1 启动子的优化

1．1．2 目的基因的修饰

1．1．3 加入核质结合区(MAR)结构

1．2 Bt抗虫基因工程

1．2．1 Bt抗虫基因的应用

1．2．2 Bt抗虫基因工程存在的问题

1．3 耐盐基因工程

1．4 研究目的和意义

2 Bt基因不同结构植物表达载体的构建及烟草转化

2．1 材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 植物转化载体

2．1．3 常用生化试剂和培养基的配制

2．1．4 主要试验仪器

2．2 方法

2．2．1 载体构建

2．2．2 农杆菌介导的烟草遗传转化

2．2．3 转基因烟草的PCR检测

2．2．4 转基因烟草外源基因转录水平的检测

2．2．5 酶联免疫检测Bt毒蛋白

2．2．6 抗虫试验

2．2．7 数据分析

2．3 结果分析

2．3．1 多基因植物转化载体的检测

2．3．2 转基因烟草的获得

2．3．3 转基因烟草的DNA检测

2．3．4 转基因烟草外源基因转录水平的检测

2．3．5 酶联免疫毒蛋白检测

2．3．6 抗虫试验

2．4 小结

3 抗虫及耐盐多基因表达载体的构建及烟草转化

3．1 材料

3．1．1 受体材料

3．1．2 植物转化载体

3．1．3 常用生化试剂和培养基的配制

3．1．4 主要试验仪器

3．2 方法

3．2．1 载体构建

3．2．2 农杆菌介导的烟草遗传转化

3．2．3 转基因烟草的移栽及盐胁迫处理

3．2．4 土含盐量的检测

3．2．5 转基因烟草的PCR检测

3．2．6 株高、叶绿素含量和相对电导率的测定

3．2．7 光合参数和叶绿素荧光参数的测定

3．2．8 转基因烟草外源基因转录水平的检测

3．2．9 酶联免疫检测Bt毒蛋白

3．2．10 数据分析

3．3 结果分析

3．3．1 多基因植物转化载体的检测

3．3．2 转基因烟草的获得

3．3．3 土含盐量的检测

3．3．4 转基因烟草的DNA检测

3．3．5 株高的测定

3．3．6 叶绿素含量的测定

3．3．7 相对电导率的测定

3．3．8 光合参数和叶绿素荧光参数的测定

3．3．9 耐盐性指标的主成分分析

3．3．10 转基因烟草外源基因转录水平的检测

3．3．11 毒蛋白含量的测定

3．4 小结

4 讨论

4．1 Bt基因不同结构表达载体的构建及烟草转化

4．2 抗虫及耐盐多基因表达载体的构建及烟草转化

5 结论

参考文献

附录

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作者简介

致谢

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摘要

虫害和土壤盐渍化一直是阻碍农林作物生产的两大重要因素，植物基因工程技术的发展为有效解决这两个问题提供了一条途径。为了得到高效抗虫以及既抗虫又耐盐的植物转化载体，以大肠杆菌DH10B、农杆菌EHA105和烟草为主要试验材料，通过调换Bt基因转录表达框顺序，改变启动子方向，加入中间隔断，改变选择标记基因的方向和添加耐盐基因等方法，构建不同结构的植物转化载体。利用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化，对转化植株进行PCR鉴定，通过荧光定量PCR进行mRNA转录丰度的研究，通过酶联免疫吸附剂测定方法和饲虫试验对两种Bt毒蛋白的表达量及抗虫性进行鉴定，利用盐胁迫对转化植株的耐盐性进行检测。得到以下研究结果:
　　1、共构建了10个不同结构的植物转化载体，其中N14，N15，N17，N20，N22均含Cry1Ac和Cry3A两个抗虫基因，B2含Cry1Ac和gus两个外源基因;载体N23，N24，N25，N26是在已有的具双价抗虫基因（Cry1Ac和Cry3A）载体N5的基础上，分别添加mtlD，BADH，mtlD+BADH，mtlD+BADH+SacB耐盐基因而得。将上述11个载体对烟草进行遗传转化，并进行PCR检测，共得到转基因株系76个。
　　2、Bt基因的排列顺序不同的两个载体，N15（Cry1Ac基因处于下游）的Cry1Ac毒蛋白平均表达量为6.69μg·g-1，是Cry3A毒蛋白表达量(1.26μg·g-1)的5.3倍;N17（Cry3A基因位于下游）的Cry3A毒蛋白平均表达量为0.82μg·g-1显著低于Cry1 Ac毒蛋白表达量（4.05μg·g-1）。N15和N17的Cry1Ac和Cry3A基因转录丰度均未达到显著差异。结果表明，Bt基因的排列顺序对其转录没有产生影响，对两个Bt基因毒蛋白表达的高低也没有影响。
　　3、Cry3A基因启动子方向不同的两个载体，N20的Cry3A毒蛋白平均表达量为2.67μg·g-1，比N5（1.81μg·g-1）的高1.5倍;载体N5的Cry1 Ac毒蛋白平均表达量为12.48μg·g-1，比N20（7.31μg·g-1）的高1.7倍。从基因的转录水平来看，N20的Cry3A基因平均转录丰度(7.36×107)比N5(4.31×107)的高1.7倍。结果表明，改变Cry3A基因启动子的方向，提高了Cry3A基因的表达量和稳定性，但在一定程度上降低了Cry1Ac基因的表达量。
　　4、载体N14的Cry3A基因两端加入中间隔断，Cry1Ac和Cry3A毒蛋白平均表达量均低于无隔断的N5的毒蛋白表达量，其中N5的Cry3A毒蛋白平均表达量(1.81μg·g-1)比N14（0.30μg·g-1）的高6倍;载体N22比N20多144一个中间隔断，Cry1Ac毒蛋白平均表达量(4.19μg·g-1)显著低于N20(7.31μg·g-1)，Cry3A毒蛋白平均表达量没有显著差异。N14与N5的两个Bt基因平均转录丰度大小相反;N20与N22的Cry1Ac基因平均转录丰度未达到显著差异;Cry3A基因平均转录丰度(7.36×107)显著高于N22(3.28×107)。结果表明，加入中间隔断一定程度上降低了两个Bt基因的毒蛋白表达量，但对其转录不存在特定规律。
　　5、载体B2选择标记基因nptⅡ的方向与其它6个载体相反，Cry1Ac毒蛋白平均表达量(0.26μg·g-1)显著低于其它载体。B2的Cry1Ac基因平均转录丰度(3.83×105)也显著低于其它载体。结果表明，改变nptⅡ基因的方向，可能严重抑制了Cry1Ac基因的表达，甚至导致其不表达。
　　6、饲虫试验结果表明，各转基因烟草株系均能对鳞翅目害虫棉铃虫幼虫和鞘翅目茄二十八星瓢虫产生抗性;各转基因载体的杀虫效果大致与毒蛋白表达量的高低相符。
　　7、盐分胁迫处理36 d时，对4个携带耐盐基因载体的转化植株与未转基因对照之间株高、叶绿素含量、相对电导率、光合参数和叶绿素荧光参数的影响程度等均不存在显著性差异，表明转入mtlD，BADH, mtlD+BADH，mtlD+BADH+ SacB耐盐基因并未显著提高烟草的耐盐性。
　　8、加入单个耐盐基因mtlD或BADH限制了Bt毒蛋白的表达;加入两个耐盐基因mtlD和BADH的N25，其Cry1Ac和Cry3A毒蛋白均得到表达，但表达量较低;加入三个耐盐基因mtlD，BADH, SacB的N26，其Cry1Ac毒蛋白未得到表达，Cry3A毒蛋白得到了低量的表达。

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