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苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定及杀虫基因的克隆

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摘要

1 引言

1．1 苏云金芽孢杆菌简介

1．2 苏云金芽孢杆菌的生物学特性及分布

1．3 苏云金芽孢杆菌的杀虫毒素

1．4 苏云金芽孢杆菌的杀虫基因

1．4．1 苏云金芽孢杆菌cry晶体蛋白的命名及分类

1．4．2 苏云金芽孢杆菌cry晶体蛋白的鉴定方法

1．5 苏云金芽孢杆菌杀虫基因与生物活性之间的关系

1．6 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料及仪器

2．1．1 土壤样品

2．1．2 培养基

2．1．3 引物序列

2．1．4 使用试剂

2．1．5 仪器设备

2．2 研究方法

2．2．1 Bt菌株的分离

2．2．2 模板的制备

2．2．3 PCR反应

2．2．4 酶切分析

2．2．5 PCR-RFLP鉴定体系

2．2．6 琼脂糖凝胶电泳

2．2．7 SDS-PAGE蛋白电泳分析

2．2．8 DNA回收

2．2．9 连接反应

2．2．10 转化反应

2．2．11 阳性重组子的筛选与鉴定

2．2．12 序列测定及分析

2．2．13 苏云金芽孢杆菌杀虫活性的测定

3 结果与分析

3．1 菌株分离及镜检结果

3．2 基因型鉴定

3．3 新基因的鉴定及测序

3．3．1 菌株WYZ-54的鉴定及部分序列的测序

3．3．2 菌株FPT-25的鉴定及部分序列的克隆测序

3．4 生物活性测定

3．4．1 对鳞翅目昆虫的生物活性测定

3．4．2 对鞘翅目昆虫的生物活性测定

4．讨论

5．结论

参考文献

在读期间发表论文

作者简历

致谢

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摘要

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种可以形成芽孢的革兰氏阳性菌，目前已成为产量最大、应用面积最广的微生物杀虫剂。随着Bt制剂的深入应用，出现了害虫抗性及杀虫图谱窄等问题，因此筛选新的Bt基因和发掘已知基因的新活性具有重要的现实意义。
　　 本研究从河北省五岳寨地区采集了756份土壤样品，采集对象为地表以下5公分的腐殖土，通过温度筛选法分离得到72株Bt菌株。光学显微镜下观测菌株的晶体形态发现伴孢晶体包括了圆形、菱形、椭圆形、方形、不规则形等多种形态，充分体现五岳寨地区苏云金芽孢杆菌资源丰富并具有良好的多态性。
　　 通过PCR-RFLP鉴定体系对分离得到的72株菌株进行鉴定，利用26对通用引物进行PCR扩增鉴定基因型。结果表明，从这些菌株中发现13种不同的基因型和9种基因组合，其中基因型包括cry1类，cry2类，cry3类，cry4类，cry6类，cry8类，cry9类，cry11I类，cry18类，cry22类，cry26类，cry32类和cry11类，其中所占比例最大的是含有cry8类基因的菌株，为38株，其次为含cry1类和cry2类基因型的菌株，分别为30株和14株，另有10株未鉴定出基因型，可能含有新基因，需要借助其他方法进一步确定。
　　 SDS-PAGE蛋白分析结果表明，大部分菌株均会表达130kDa、90kDa、60kDa大小的蛋白。其中含有cry1+cry2基因组合的菌株大多表达130kDa和60kDa大小的蛋白，仅包含cry1或cry2类基因的菌株大多只表达130kDa大小的蛋白，其晶体形态多为菱形;仅包含cry8类基因的菌株多数只表达130kDa大小的蛋白，其晶体形态多为圆形或椭圆形;同时含有cry3+cry8类基因组合的菌会表达130kDa大小的蛋白;含有cry22类基因的菌株表达约90kDa大小的蛋白，其晶体形态为圆形;而未鉴定出基因类型的菌株其蛋白大小表达多样。
　　 在对榆兰叶甲幼虫的生物活性测定中，菌株WYZ-54表现出了较强的活性，其4d的校正死亡率达到80％，但是只表现出cry1、cry2和cry1I三类基因型，并未出现对鞘翅目具有活性的cry3或cry8类基因，通过克隆得到1500bp左右的部分基因序列，通过NCBIBlast分析，与GenBank中已知的Bt基因序列进行比对，结果显示菌株WYZ-54克隆的部分基因序列与GenBank中的已知模式基因Cry1Ia-likeprotein(cry1Ia)gene（序列号:FJ617448.1）的相似性最高，为99％。
　　 FPT-25为实验室保留菌株，在对暗黑鳃金龟幼虫的生物活性测定中表现出较高活性，其14天校正死亡率达70％。经PCR鉴定但未能确定其基因型，通过SDS-PAGE蛋白电泳分析，发现其表达80kDa和50kDa两条条带的蛋白，而并未表达一般对鞘翅目昆虫具有活性的130kDa的蛋白。根据Beron的研究方法，使用3对引物分别进行PCR扩增，回收得到1900bp左右的基因片段，通过序列比对，未发现与GenBank中已知的Bt基因存在相似性，推测含有新型基因，有待进一步研究。
　　 对72株Bt菌株的生物活性测定选取小菜蛾、斜纹夜蛾、华北大黑鳃金龟和铜绿丽金龟幼虫四种供试昆虫。结果显示，对小菜蛾具有较高毒力的Bt菌株(4d校正死亡率≥90％)有11株，其中校正死亡率达到100％有9株;对斜纹夜蛾具有较高毒力的Bt菌株（4d校正死亡率≥90％）有13株，其中校正死亡率达到100％的有12株;有7株菌株对铜绿丽金龟幼虫具有较高杀虫活性（14d校正死亡率≥90％）;菌株WYZ-12、WYZ-16、WYZ-30、WYZ-52对华北大黑鳃金龟幼虫的活性较高，14d的校正死亡率分别为60％、80％、60％、80％，以实验室保存菌株HBF-18为对照菌株，通过LC50毒力测定，发现其中两株菌株对华北大黑鳃金龟的毒力效果略高于对照菌株，而另两株较低。

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