口蹄疫病毒VP1基因转染树突状细胞对T淋巴细胞的活化作用研究

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口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMD virus，FMDV）引起偶蹄动物多发的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。严重危害家畜的生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失，直接威胁着国际贸易和国家声誉及人类食品卫生，因而受到人们的普遍关注。目前，针对预防口蹄疫疾病的爆发和流行，多数发展中国家主要采用注射灭活病毒疫苗的方法。但灭活疫苗存在灭活不彻底和保护期短等缺点。因此，新型口蹄疫疫苗及免疫策略的研究已成为亟待解决的焦点问题。口蹄疫病毒衣壳由4种结构蛋白VP1,VP2,VP3,VP4各60个拷贝组成，VP1蛋白又称1D蛋白，其基因位于基因组的2977-3615，编码213个氨基酸。早期研究表明，结构蛋白VP1暴露在病毒颗粒的表面，是诱导产生中和抗体的主要成分。
　　本实验以质粒pMD18-VP1为模板，经过EcoRI和HindIII双酶切鉴定和基因序列测定得到FMDV的VP1基因，对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)分别以相同的限制性酶EcoRI和HindIII消化后，经T4连接酶连接构建重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌DH5α后得到重组质粒，经酶切鉴定正确后，对重组质粒pcDNA3.1-VP1进行测序，结果表明，VP1基因定向克隆到表达载体pcDNA3.1中。将VP1基因与GenBank发表的序列进行同源性比较，证明本研究所用毒株与Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码序列(NCBI登陆号分别为AY333431.1)同源性最高，可达100％。结果证明pcDNA3.1-VP1重组质粒构建成功。为鉴定pcDNA3.1-VP1基因能否在真核细胞中表达，本研究用重组质粒pcDNA3.1-VP1转染小鼠的单核细胞源树突状细胞(MoDC)，同时用空载体转染MoDC作为阴性对照。Western blot检测结果显示，在分子量约为60kD处有一条明显的蛋白条带，而空载体在相应位置未见蛋白条带。为了验证转染VP1的MoDC能否有效地激活淋巴结T细胞，本研究用转染VP1的MoDC和淋巴结T细胞组成共培养体系，以负载了灭活FMDV抗原的MoDC（FMDV+DC）与淋巴结T细胞作为阳性对照，以单纯的MoDC为阴性对照，用ELISA法检测不同时间点IFN-γ水平变化。结果显示，转染VP1的MoDC与负载了灭活FMDV的MoDC一样，均可有效地激活淋巴结T细胞，但转染VP1基因的MoDC可能激活的是淋巴结CD8+T细胞，并能诱导其释放大量的IFN-γ。这些试验结果为进一步研究DC提呈FMDV抗原机制和新型疫苗的开发奠定了重要基础。

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作者
李杰;
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作者单位

河北农业大学;

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授予单位河北农业大学;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名王家鑫;
年度 2009
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病毒病;血清学;
关键词
口蹄疫病毒; 基因转染; 树突状细胞; T淋巴细胞; 灭活疫苗;

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