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17β雌二醇通过PI3K/Akt途径抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人髓核细胞的凋亡

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 主要试剂

3细胞培养

4形态学观察

5 统计分析

结果

2 流式细胞学分析

3 细胞增殖活性检测（CCK-8）

4 Caspase-3活性检测

5蛋白印迹法

6 实时定量PCR检测

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:雌激素与椎间盘退变相关性的研究进展

致谢

个人简历

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摘要

目的：
　　以往研究证实肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)能够诱导髓核细胞凋亡。17β雌二醇能抑制细胞凋亡的功能也得到了广泛的证实。PI3K/Akt途径是抑制细胞凋亡的细胞传导通路。本研究的目的是探索17β雌二醇能否通过PI3K/Akt途径抑制肿瘤坏死因子-α诱导的人髓核细胞凋亡。
　　方法：
　　用人髓核细胞株进行培养，按照以下处理条件进行实验分组，每组为6个样本。Ⅰ组（对照组）：未对人髓核细胞进行特殊处理；Ⅱ组：用TNF-α（100 ng/ml）对人髓核细胞进行干预；Ⅲ组：用17β-E2（10μm/L）预先处理后加入TNF-α（100 ng/ml）对人髓核细胞进行干预；Ⅳ组：用17β-E2（10μm/L）和MK2206(10μm/L，PI3K/AKT途径抑制剂)同时预先处理后加入TNF-α（100 ng/ml）对人髓核细胞进行干预。分别从细胞形态学、蛋白分子和核酸分子水平对人髓核细胞凋亡情况进行评估，运用：1倒置相差显微镜对人髓核细胞进行形态学观察；2流式细胞学对人髓核细胞的早期凋亡率进行定量分析；3细胞增殖活性检测(CCK-8)对人髓核细胞的增殖活性进行定量分析；4用caspase-3活性检测试剂盒检测人髓核细胞中caspase-3蛋白活性；5用蛋白印迹法(Western blot)对人髓核细胞中pro-caspase-3、caspase-3/P17、cleaved PARP, PARP、Akt和 p-Akt蛋白表达进行定量检测，以相对灰度值（/GADPH）表示；6用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法对人髓核细胞中 caspase-3/p17、PARP和Akt mRNA表达进行定量检测，并且以相对ct值（/GADPH）表示。
　　结果：
　　1人髓核细胞呈现出多角形生长，且轮廓明显，细胞核呈现出圆形以及椭圆形，细胞可在6-8小时贴壁生长，7-8天可进入对数生长期。
　　2倒置相差显微镜，在Ⅰ组中，未见人髓核细胞出现明显凋亡；与Ⅰ组相比，Ⅱ组中可见人髓核细胞出现明显凋亡；Ⅲ组中，未见人髓核细胞出现明显凋亡；与Ⅲ组相比，Ⅳ组中可见人髓核细胞出现明显凋亡。
　　3流式细胞学分析结果显示：Ⅰ组人髓核细胞早期凋亡率为12.05％±2.27%；Ⅱ组人髓核细胞早期凋亡率为30.8%±8.36%；Ⅲ组人髓核细胞早期凋亡率为13.81%±1.97%；Ⅳ组人髓核细胞早期凋亡率为30.01%±7.33%。Ⅰ组早期凋亡率明显低于Ⅱ组（P＜0.001），Ⅱ组早期凋亡率明显高于Ⅲ组（P＜0.001），Ⅲ组早期凋亡率明显低于Ⅳ组（P＜0.001）。
　　4用细胞增殖与活性检测(CCK-8)结果显示：Ⅰ组人髓核细胞增殖活性 OD值为90.32%±3.25%；Ⅱ组人髓核细胞增殖活性 OD值为37.78%±3.28%；Ⅲ组人髓核细胞增殖活性OD值为88.67%±2.87%；Ⅳ组人髓核细胞增殖活性OD值为38.97%±3.49%。Ⅰ组细胞增殖活性明显高于Ⅱ组（P＜0.001），Ⅱ组细胞增殖活性明显低于Ⅲ组（P＜0.001），Ⅲ组细胞增殖活性明显高于Ⅳ组（P＜0.001）。
　　5用caspase-3活性检测试剂盒来检测细胞中caspase-3蛋白活性，与Ⅰ组相比，Ⅱ组中人髓核细胞在TNF-α干预下caspase-3蛋白活性增加3.9倍，Ⅲ组中，在17β-E2预处理后人髓核细胞的caspase-3的活性增加1.1倍，而Ⅳ组，在17β-E2和MK2206预处理后caspase-3蛋白活性增加3.7倍。Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅱ组和Ⅲ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间有统计学差异（P＜0.001）。
　　6 Western blot结果显示：四组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组)中caspase-3/p17蛋白的灰度值（/GAPDH）分别0.13±0.01、0.39±0.01、0.12±0.01、0.38±0.01；四组中cleaved PARP蛋白的灰度值（/GAPDH）分别0.13±0.01、0.33±0.01、0.14±0.01、0.32±0.01；四组中pro-caspase-3蛋白的灰度值（/GAPDH）分别0.40±0.01、0.11±0.01、0.38±0.01、0.12±0.01；四组中PARP蛋白的灰度值（/GAPDH）分别0.35±0.02、0.16±0.01、0.35±0.01、0.15±0.01；四组中p-Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）分别0.14±0.02、0.30±0.01、0.43±0.02、0.13±0.02，以上蛋白的灰度值在Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅱ组和Ⅲ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间有统计学差异（P＜0.001）。而四组中Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）分别0.49±0.02、0.48±0.01、0.49±0.02、0.48±0.01，其组间差异无统计学意义。TNF-α干预后的人髓核细胞中p-Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）在0到24小时内升高，而在24到48小时下调，24小时为p-Akt的表达高峰（0.10±0.01、0.18±0.01、0.33±0.02、0.18±0.01、0.10±0.01），0时与12时、12时与24时、24时与36时和36时与48时之间有统计学差异（P＜0.001）。但Akt蛋白表达水平保持不变（0.48±0.01、0.48±0.01、0.49±0.02、0.48±0.02、0.49±0.01，P＞0.05）。虽然，17β-E2干预后的人髓核细胞中 p-Akt蛋白的灰度值（/GAPDH）在0到48小时内升高（0.06±0.01、0.15±0.01、0.25±0.02、0.33±0.02、0.44±0.01），以上蛋白灰度值各组之间均有统计学差异（P＜0.001），但Akt蛋白表达水平保持不变（0.44±0.03、0.44±0.03、0.45±0.02、0.46±0.04、0.47±0.05，P＞0.05）。
　　7实时定量PCR检测结果显示：caspase-3/p17 mRNA的ct值（/对照组）分别2.45±0.23、0.98±0.15、2.50±0.13，四组中PARP mRNA的ct值（/对照组）分别0.30±0.03、0.95±0.03、0.27±0.04，以上mRNA的ct值在Ⅱ组和Ⅲ组、Ⅲ组和Ⅳ组之间有统计学差异（P＜0.001）。Akt mRNA的ct值（/对照组）分别0.96±0.02、0.99±0.02、0.97±0.02，其组间差异无统计学意义。
　　结论：
　　肿瘤坏死因子-α诱导人髓核细胞的凋亡，17β-雌二醇可显著抑制髓核细胞的凋亡，这是通过激活PI3K/Akt途径实现的。

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