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鞘磷脂合成酶2缺乏对小鼠脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响及其机制研究

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引言

第一部分鞘磷脂合成酶2缺乏减轻了小鼠脑缺血再灌注损伤

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分鞘磷脂合成酶2减轻了小鼠脑缺血再灌注损伤后的炎症反应

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分鞘磷脂合成酶2缺乏通过抑制TLR4向脂筏区域的募集发挥抗炎作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:鞘磷脂代谢与神经系统疾病

致谢

个人简历

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摘要

缺血性脑卒中发病率高、病死率高、致残率高、复发率高,是危害我国人民健康的主要疾病之一。虽然现在已明确了超早期溶栓的有效性,但由于其严格的治疗时间窗,其临床应用受到一定的限制。因此,脑缺血后如何减轻继发性脑损伤是目前临床面临的重要课题。研究表明脑缺血后发生在缺血半暗带的过度的炎症反应是造成继发性脑损伤的主要原因:阻断抗炎信号通路加重继发性脑损伤,而抑制炎症介质的过度表达则减轻脑缺血后继发性脑损伤。因此,寻找炎症反应的有效靶点进行靶向干预,是减轻缺血再灌注损伤后的炎症反应的关键。鞘磷脂由鞘氨醇、脂酸和磷酸胆碱构成,是人体内含量最多的鞘磷脂,也是构成生物膜的重要组分,与卵磷脂并存于细胞膜外侧,广泛存在于生物组织内,在脑组织中含量尤为丰富。鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase,SMS)是鞘磷脂合成途径中的最后一个酶,SMS有两种同工酶:SMS1和SMS2。SMS1主要存在于高尔基体,而SMS2主要存在于质膜上,在脑组织中广泛表达。其中SMS2是炎症反应中重要的调控因子。SMS2缺乏可抑制由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞TLR4/NF-κB通路的活化,提示SMS2参与了对炎症反应的调控。但目前关于SMS2对脑缺血再灌注损伤后炎症反应的作用及机制尚不清楚,仍有待于进一步研究。近期研究发现,脑缺血后小胶质细胞分泌大量的半乳糖凝集素-3(galectin-3),galectin-3是TLR4的内源性配体,其通过诱导TLR4募集到脂筏区域并与之结合激活TLR4通路,加重炎症反应。脂筏是细胞膜上由神经鞘磷脂、胆固醇和鞘糖脂相互作用形成的细胞信号转导微结构域,与膜的信号转导、蛋白质分选密切相关。
　　第一部分：鞘磷脂合成酶2缺乏减轻了小鼠脑缺血再灌注损伤
　　目的:通过对野生型(WT)小鼠和SMS2敲除(SMS2-/-)小鼠在脑缺血再灌注损伤后进行神经功能缺损评分、脑梗死体积测定,观察SMS2缺乏对小鼠脑缺血再灌注损伤的作用。
　　方法:实验选用8-12周龄的健康雄性C56BL/6小鼠及以C57BL/6为背景的SMS2敲除小鼠为研究对象。采用线栓法建立的小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型。实验分为WT小鼠和SMS2-/-小鼠两组,分别在手术造模后24小时和72小时进行神经功能缺损评分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色测定脑梗死体积。
　　结果：
　　1.蔗糖密度梯度离心结果显示：与正常组相比，在脑缺血再灌注后24小时和72小时，TLR4在脂筏区域大量表达；与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠TLR4在脂筏区域的表达明显减少。
　　2.LC-MS/MS测定SM含量的结果显示：与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠C14-SM，C16-SM，C18:1-SM，C18-SM，C20:1-SM和C24:1-SM在脂筏区域的含量明显降低，差异具有统计学差异（P<0.05)。
　　结论：
　　1.本实验通过应用线栓法成功建立了小鼠短暂性右侧大脑中动脉闭塞模型，发现在脑缺血再灌注后72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的神经功能明显得到改善，脑梗死体积显著减少。
　　2.SMS2缺乏在脑缺血再灌注损伤后发挥的脑保护作用，有可能与其减少小胶质细胞的激活、减少NF-κB的核转位、减少促炎因子的表达有关。
　　3.SMS2缺乏通过减少脂筏组分SM的含量影响脂筏的功能，从而抑制TLR4受体由非脂筏区域向脂筏区域的募集，减少TLR4/MD2复合体的形成，进而抑制下游TLR4/NF-κB炎症通路的激活。
　　第二部分：鞘磷脂合成酶2缺乏减轻了小鼠脑缺血再灌注损伤后的炎症反应
　　目的：
　　通过测定小鼠脑缺血再灌注损伤后缺血半暗带炎症因子的表达、小胶质细胞的浸润情况及TLR4、NF-κB的蛋白表达水平观察鞘磷脂合成酶2缺乏对小鼠脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响。
　　方法：
　　实验选用8-12周龄的健康雄性C56BL/6（WT）小鼠及以C57BL/6为背景的SMS2敲除小鼠（SMS2-/-）为研究对象。采用线栓法建立的小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型。将WT小鼠和SMS2-/-小鼠随机分为2组：假手术组（Sham）和大脑中动脉闭塞组（tMCAO）。各组小鼠分别在手术造模后24小时和72小时，应用RT-PCR检测炎症因子的表达，应用免疫荧光染色的方法观察小胶质细胞的浸润，应用Western-blot检测NF-κB的核转位情况，应用流式细胞仪检测小胶质细胞表面TLR4及TLR4/MD2复合体的表达情况。
　　结果：
　　1.RT-PCR的结果显示：在脑缺血再灌注损伤后24小时和72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠脑组织缺血半暗带炎症因子（IL-1β， galectin-3）mRNA水平的表达明显降低，抑炎因子Arg-1的mRNA水平表达明显降低，差异具有统计学差异（P<0.05)。
　　2.Western blot的结果显示：与正常组相比，galectin-3蛋白水平的表达，在脑缺血再灌注后48小时和72小时明显增高，差异具有统计学差异（P<0.05)；在脑缺血后72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的galectin-3蛋白水平的表达明显降低，差异具有统计学差异（P<0.05)。
　　3.免疫荧光的结果显示：与非缺血侧相比，缺血侧Iba-1+的小胶质细胞明显增多，差异具有统计学差异（P<0.05)；在脑缺血再灌注后72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠缺血侧galectin-3+Iba-1+的小胶质细胞数量明显减少，差异具有统计学差异（P<0.05)；而Iba-1+的小胶质细胞数量与WT小鼠相比无明显改变，不具有统计学差异（P>0.05)。
　　4.Western blot的结果显示：在脑缺血再灌注损伤后24小时和72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠脑组织缺血半暗带NF-κB的核转位明显减少，差异具有统计学差异（P<0.05)。
　　5.流式细胞仪分析结果显示：在脑缺血再灌注后72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠小胶质细胞表面TLR4/MD2复合体的表达减少；而TLR4的表达较WT小鼠无明显改变。
　　第三部分：鞘磷脂合成酶2缺乏通过抑制TLR4向脂筏区域的募集发挥抗炎作用
　　目的：
　　通过测定小鼠脑缺血再灌注损伤后TLR4在脂筏组分和非脂筏组成的表达情况，以及鞘磷脂合成酶2缺乏后对脂筏成分及功能的影响，探讨其在脑缺血再灌注损伤后发挥抗炎作用的可能作用机制。
　　方法：
　　采用8-12周龄的健康雄性 C57BL/6小鼠（WT）及以C57BL/6小鼠为背景的SMS2敲除小鼠（SMS2-/-）作为研究对象，通过线栓法建立小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型。将WT和SMS2-/-小鼠随机分为2组：假手术组（Sham）和大脑中动脉闭塞组（tMCAO）。各组小鼠于手术造模后24小时和72小时，应用蔗糖梯度离心的方法检测脂筏区域及非脂筏区域TLR4的表达情况，应用液相串联质谱的发放（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）测定各组分鞘磷脂（sphingomyelin，SM）的含量。
　　结果：
　　1.蔗糖密度梯度离心结果显示：与正常组相比，在脑缺血再灌注后24小时和72小时，TLR4在脂筏区域大量表达；与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠TLR4在脂筏区域的表达明显减少。
　　2.LC-MS/MS测定SM含量的结果显示：与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠C14-SM，C16-SM，C18:1-SM，C18-SM，C20:1-SM和C24:1-SM在脂筏区域的含量明显降低，差异具有统计学差异（P<0.05)。
　　结论：
　　1.本实验通过应用线栓法成功建立了小鼠短暂性右侧大脑中动脉闭塞模型，发现在脑缺血再灌注后72小时，与WT小鼠相比，SMS2-/-小鼠的神经功能明显得到改善，脑梗死体积显著减少。
　　2.SMS2缺乏在脑缺血再灌注损伤后发挥的脑保护作用，有可能与其减少小胶质细胞的激活、减少NF-κB的核转位、减少促炎因子的表达有关。
　　3.SMS2缺乏通过减少脂筏组分SM的含量影响脂筏的功能，从而抑制TLR4受体由非脂筏区域向脂筏区域的募集，减少TLR4/MD2复合体的形成，进而抑制下游TLR4/NF-κB炎症通路的激活。

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