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硫化氢对Takotsubo心肌病的保护作用及其机制探讨

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引言

第一部分外源性硫化氢对Takotsubo心肌病心功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分外源性硫化氢通过抑制NADPH氧化酶减轻Takotsubo心肌病大鼠心肌氧化应激损伤

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分硫化氢通过抑制p38MAPK/NOX4/ROS通路减轻ISO引起的H9c2细胞损伤

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:Takotsubo心肌病的研究进展

致谢

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摘要

Takotsubo心肌病(Takotsubo cardiomyopathy,TCM)发病急骤，临床症状与急性冠脉综合征相似，临床中诊断为急性冠脉综合征的患者中约有2％的患者为Takotsubo心肌病。Takotsubo心肌病急性死亡率大约1％-4.2％。由于此病急性发病时左心室收缩末期心尖部、心中部运动不能，运动不足或运动障碍，心脏基底部收缩过度，病变时心脏形态类似于捕章鱼的鱼篓，所以命名为Takotsubo心肌病。Takotsubo心肌病多见于中老年女性患者,大部分患者发病前均有严重的精神或躯体应激性诱因，临床中患者以胸痛或心前区压榨性疼痛为首发症状，也可表现为心悸、晕厥、恶心、呕吐、呼吸困难，发病急性期可出现心源性休克、心脏骤停、室间隔缺损、急性肺水肿、呼吸衰竭、严重的室性心律失常以及心脏破裂等严重并发症。但Takotsubo心肌病室壁运动异常区域超过单支冠状动脉支配范围，且不伴有冠状动脉闭塞。由于对Takotsubo心肌病的逐渐认识和关注，临床中发现的Takotsubo心肌病病例的数量持续增加，但对其发病机制、病理变化、规范治疗仍然缺乏充分的依据。故进一步研究该疾病有重要的临床意义和社会价值。
　　硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）是继一氧化氮和一氧化碳之后，被发现的第3种气体信号分子，其在哺乳动物体内广泛存在。硫化氢在心血管系统中发挥着非常关键的保护作用。各种心肌缺血模型和过度刺激β肾上腺素受体能够使大鼠体内 H2S含量明显下降，给予外源性硫化氢或者促进内源性硫化氢产生，均可明显减小缺血再灌注心肌的损伤面积和心梗死面积，从而对心肌发挥保护作用。H2S可以通过开放心肌细胞KATP通道，减轻氧化应激损伤、促进体内NO合成，抑制血管紧张素转化酶活性，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、保护线粒体等多种机制发挥心血管的保护作用。目前，关于硫化氢对Takotsubo心肌病的保护作用机制仍不明确，本文利用Takotsubo心肌病动物模型和H9c2心肌细胞探讨Takotsubo心肌病发病机制，探讨硫化氢对Takotsubo心肌病的影响及其作用机制。本研究共分三部分。
　　第一部分：外源性硫化氢对Takotsubo心肌病心功能的影响
　　目的：
　　探讨外源性给予硫化氢是否可以调节和保护Takotsubo心肌病动物模型的心功能
　　方法：
　　1.本实验选用健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，大鼠腹腔注射异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)50mg/kg制备Takotsubo心肌病大鼠模型.
　　2.应用powerlab及换能器监测Takotsubo心肌病大鼠左心功能指标，并给予不同浓度的NaHS（10,50,100, or200μmol/kg，i.p.）预处理，筛选出对Takotsubo心肌病具有最佳保护作用的NaHS浓度，用于后续实验。
　　3.心脏超声观察Takotsubo心肌病大鼠的心功能及NaHS对Takotsubo心肌病的心功能影响。
　　4.检测Takotsubo心肌病大鼠的心肌酶及NaHS对Takotsubo心肌病的心肌酶影响。
　　5.H&E染色检测心肌组织形态学变化
　　6.检测Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织硫化氢浓度及内源性产生硫化氢的酶，观察NaHS对Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织硫化氢浓度及内源性产生硫化氢的酶的影响。
　　结果：
　　1.Takotsubo心肌病大鼠的左心室功能指标LVSP及±dp/dtmax与对照组相比显著下降，LVEDP与对照组相比显著升高。
　　2.Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中硫化氢水平明显降低，心肌组织中CSE、3-MST表达明显降低，但对心肌组织CBS表达无明显影响。NaHS可以增加Takotsubo心肌病大鼠血清及心肌组织中硫化氢水平，增加心肌组织中CSE、3-MST蛋白表达。
　　3.不同剂量的NaHS（10,50,100,200μmol/kg）能够增加Takotsubo心肌病大鼠LVSP及+dp/dtmax，降低LVEDP。NaHS100μmol/kg具有最明显的保护效应。
　　4.心脏超声结果显示，Takotsubo心肌病大鼠LVEF、LVFS明显降低，心室壁运动不规律，心尖部、心中部室壁收缩功能降低，心底部收缩正常，左心室病变时形状类似于“章鱼篓”或“气球样”改变。NaHS预处理可以升高Takotsubo心肌病大鼠LVEF、LVFS，减轻Takotsubo心肌病大鼠不规律室壁运动。
　　5.Takotsubo心肌病大鼠血浆中CK、CK-MB、LDH、AST水平均明显升高。NaHS可以降低Takotsubo心肌病大鼠CK，CK-MB，LDH和AST活性。
　　6.Takotsubo心肌病大鼠心肌H＆E染色显示心肌纤维完整，排列整齐，染色较均匀，结构较清晰，细胞核、细胞装完整，未见细胞坏死、炎症细胞浸润。
　　结论：
　　1.大鼠给予异丙肾上腺素可以很好的模拟临床中Takotsubo心肌病，左心功能指标、心脏超声检查均提示心功能损伤，心肌酶CK、CK-MB、LDH、AST水平明显升高。
　　2.NaHS预处理可以改善Takotsubo心肌病模型大鼠左心功能指标，提高LVEF、LVFS，减轻室壁运动的不规律。
　　3.Takotsubo心肌病大鼠血清及心肌组织中硫化氢水平降低，心肌组织CSE、3-MST蛋白表达降低。说明硫化氢在Takotsubo心肌病发病过程及病理损害过程中发挥作用。NaHS预处理可以增加Takotsubo心肌病大鼠血清及心肌组织中硫化氢水平，使心肌组织 CSE、3-MST蛋白表达增加。
　　第二部分：外源性硫化氢通过抑制NADPH氧化酶减轻Takotsubo心肌病大鼠心肌氧化应激损伤
　　目的：
　　观察和探讨硫化氢保护Takotsubo心肌病心功能的机制
　　方法：
　　1.心肌组织DHE染色观察心肌组织超氧阴离子水平。
　　2.应用H2O2、MDA、SOD、GSH试剂盒检测血浆和心肌组织中氧化应激指标的变化。
　　3.Western blot检测心肌组织中NOX2、NOX4、p67蛋白的表达。
　　4.TUNEL染色观察心肌组织凋亡的变化。
　　5.Western blot检测心肌组织中促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl-xL蛋白的表达。
　　结果：
　　1.左心室冰冻切片DHE染色结果显示:Takotsubo心肌病大鼠心肌组织中超氧阴离子水平显著增加，NaHS预处理能够降低Takotsubo心肌病大鼠心肌组织中超氧阴离子。
　　2.Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中H2O2水平升高。NaHS预处理可以降低Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中H2O2水平。
　　3.Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中MDA水平升高。NaHS预处理可以降低Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中MDA水平。
　　4.Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中GSH水平降低。NaHS预处理并未升高Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中GSH水平。
　　5.Takotsubo心肌病大鼠血浆及心肌组织中SOD活性没有变化，NaHS预处理也不改变SOD活性。
　　6.Takotsubo心肌病大鼠心肌组织中NOX4和p67蛋白表达水平升高， NaHS预处理可以降低Takotsubo心肌病大鼠心肌组织中NOX4和p67蛋白表达。
　　7.TUNEL染色结果显示：Takotsubo心肌病大鼠心肌细胞凋亡数量较明显增加，NaHS可以减少Takotsubo心肌病大鼠心脏组织中凋亡细胞的数量。
　　8.Takotsubo心肌病大鼠心肌组织抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达降低，促凋亡蛋白Bax表达增加，Bax/Bcl-xL比值升高。NaHS增强心肌组织抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达，抑制促凋亡蛋白Bax表达，Bax/Bcl-xL比值降低。
　　结论:
　　1.氧化应激参与了Takotsubo心肌病大鼠病理过程，NaHS可以降低Takotsubo心肌病大鼠血浆和心肌组织氧化应激水平。
　　2.NaHS通过抑制Takotsubo心肌病大鼠心肌组织NOX4、p67蛋白表达，从而降低Takotsubo大鼠心肌病氧化应激损伤。
　　3.NaHS减轻Takotsubo心肌病大鼠心肌细胞的凋亡。
　　第三部分：硫化氢通过抑制p38MAPK/NOX4/ROS通路减轻异丙肾上腺素引起的H9c2细胞损伤
　　目的：
　　以H9c2细胞作为研究对象，探讨硫化氢对Takotsubo心肌病的保护机制。
　　方法：
　　1.细胞培养
　　H9c2细胞以高糖 DMEM培养基培养，内含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100μg/mL。置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。
　　2.乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放检测细胞毒性
　　H9c2细胞以5000个细胞/孔接种到96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，给予不同浓度的ISO（10、50、100、200μM）处理2h，按照试剂盒说明书要求加入试剂，测定490 nm处各孔的吸光度，计算LDH释放百分率。以筛选出最小细胞损伤浓度，选择ISO100μM用于后续实验。细胞给予不同浓度的NaHS(10、50、100、200μM)预处理，观察NaHS对ISO100μM处理的H9c2细胞的保护作用，筛选出最佳浓度，选择NaHS50μM用于后续试验。
　　3.CCK8法检测各组H9c2细胞活性
　　对数生长期H9c2细胞以5000细胞/孔接种于96孔培养板。细胞贴壁后分别给予ISO100μM处理2h；给予NaHS50μM预处理30 min后给予ISO100μM处理2h。酶标仪检测在450 nm波长处各孔的OD值。
　　4.DHE染色检测正常对照组、ISO组及NaHS+ISO组H9c2细胞超氧阴离子的变化。
　　5.利用Western blot方法检测正常对照组、ISO组 H9c2细胞以及NaHS+ISO组H9c2细胞NOX4蛋白的表达。
　　6.利用Western blot方法检测ISO组H9c2细胞以及 NaHS+ISO组H9c2细胞p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK蛋白的表达。
　　7.利用Western blot方法检测给予p38抑制剂 SB203580对 ISO组H9c2细胞NOX4蛋白表达的影响。
　　8.利用Western blot方法检测给予JNK抑制剂SB600125对ISO组细胞NOX4蛋白表达的影响。
　　结果：
　　1.LDH释放实验发现H9c2细胞给予ISO的浓度为100μM时，细胞的LDH释放最多，说明ISO100μM对细胞的损伤较明显，选择ISO100μM作为后续的实验浓度。
　　2.LDH释放实验发现不同浓度的NaHS均可以减轻ISO对H9c2细胞损伤，其中NaHS50μM的保护作用最为明显，选择NaHS50μM用于后续试验。
　　3.CCK8实验显示NaHS预处理能够升高ISO对H9c2细胞的活力。
　　4.NaHS降低ISO引起的H9c2细胞超氧阴离子水平。
　　5.NaHS预处理可降低ISO引起的H9c2细胞NOX4蛋白表达
　　6.NaHS预处理可降低ISO引起的H9c2细胞p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表达，NaHS及ISO不影响 H9c2细胞pERK/ERK蛋白表达。
　　7.p38抑制剂SB203580能够降低ISO引起的H9c2细胞NOX4蛋白表达
　　8.JNK抑制剂SB600125不影响ISO引起的H9c2细胞NOX4蛋白表达。
　　结论：
　　1.ISO可以引起H9c2细胞NOX4蛋白表达增加，细胞超氧阴离子水平增加。NaHS可以抑制ISO引起的细胞NOX4蛋白表达和超氧阴离子水平。
　　2.ISO可以引起H9c2细胞p38蛋白表达增加和JNK蛋白表达增加，说明ISO引起p38MAPK通路和JNK通路激活。NaHS可以抑制ISO引起的p38MAPK通路和JNK通路激活。
　　3.ISO是通过激活p38MAPK通路使NOX4蛋白表达增加，引起细胞氧化应激损伤，而不是通过激活JNK通路.
　　4.外源性硫化氢通过抑制p38MAPK/ NOX4/ROS通路对ISO引起的损伤发挥保护作用。

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