微小RNAs差异表达对非酒精性脂肪性肝炎相关肝纤维化的影响及分子调控机制研究

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非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是近年发病率逐渐增加的慢性肝脏疾病，属于代谢异常相关性肝病，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），可进展为肝硬化或并发肝细胞癌，严重危害人类健康，因此，NAFLD早期诊断及有效治疗是防止进展为终末期肝病的重要措施。肝穿刺活检是目前诊断NAFLD的可靠方法，但由于为创伤性检查，临床应用有一定局限性。NASH相关肝纤维化是NAFLD疾病谱中重要的病理阶段，探明其发病机制，寻求特异有效的分子诊断标志及治疗靶点至关重要。
　　MicroRNAs（miRNAs）是长约19-25个核苷酸的非编码小RNA，由70-100nt双链茎环前体经RNA酶Dicer合成，能够识别靶mRNA的3?端非编码区（3?-untranslated region，3′-UTR），导致翻译阻遏或mRNA降解。近年来研究表明 miRNAs在 NAFLD发病过程中存在差异表达，而有关miRNAs对NASH相关肝纤维化的影响研究甚少。血红素氧合酶-1（heme oxygenase1，HO-1）是肝脏发生氧化应激损伤时，阻止炎症反应，发挥保护氧化组织损伤的关键基因，而HO-1在NASH相关肝纤维化发生发展过程中对miRNA的作用至今未见报道。
　　本研究通过建立 NASH相关肝纤维化动物模型，应用基因芯、生物信息学、双荧光素酶报告基因、原代细胞分离培养及 siRNA转染等技术方法，阐明miRNAs对NASH相关肝纤维化的作用及机制。并进一步探讨HO-1的靶向调控对关键miRNA的影响，观察HO-1是否能够通过调节相关miRNA发挥对脂肪性肝纤维化的调控作用，为该病的病因探索及疾病防治提供新思路。
　　第一部分 NASH相关肝纤维化小鼠肝组织差异表达miRNAs的筛选与验证
　　目的：筛选及验证NASH相关肝纤维化小鼠肝组织差异表达的miRNAs。
　　方法：选用8周龄雄性 C57BL/6J小鼠，采用胆碱-蛋氨酸缺乏（methionine-choline deficient，MCD）饮食建立NASH相关肝纤维化小鼠模型，观察小鼠肝脏生化学及肝组织病理学变化，采用Western blot技术检测小鼠肝组织纤维化相关因子的表达变化，利用LC Sciences microRNA Microarray-20.0 Mouse miRNA基因表达谱芯片筛选NASH相关肝纤维化差异表达miRNAs，并采用实时定量PCR进行验证。
　　结果：
　　MCD饮食建立NASH相关肝纤维化小鼠模型
　　1肝脏生化学变化：NASH相关肝纤维化小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ alanine aminotransferase， ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（ aspartate aminotransferase，AST）显著高于对照组，P<0.05。
　　2肝脏组织病理学特征：NASH相关肝纤维化小鼠肝组织切片呈现肝细胞大泡性脂肪变性，伴点灶状坏死及炎细胞浸润，可见窦周纤维化及汇管区扩大。
　　3肝组织纤维化相关因子的表达变化：Western blot结果显示，MCD组小鼠肝组织纤维化相关基因的表达变化与肝损伤程度相一致，伴随肝损伤程度的不断加重，纤维化相关基因转化生长因子（transforming growth factorβ1，TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Smad4、4型胶原（ Collagen Type4， Col-4）、基质金属蛋白酶2/9（matrixmetallo-proteinase-2/9，MMP-2/9）的表达显著增加，而基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1）、Smad7得表达显著降低。
　　4 miRNAs芯片结果：采用miRNAs芯片筛选NASH相关肝纤维化肝组织中差异表达 miRNAs，筛选出37个差异表达 miRNAs，其中表达上调19个（ miR-15b-5p、miR-150-5p、miR-106a-5p等），下调18个（miR-146a-5p、miR-203-3p、miR-130a-3p等）。
　　5差异表达miRNAs的验证：应用RT-PCR方法检测，结果显示NASH相关肝纤维化小鼠肝组织中 miR-15b-5p表达较对照组明显上调，而miR-146a-5p及miR-203-3p表达明显下调，尤以miR-146a-5p下调显著，与芯片结果一致（P<0.05）。
　　结论：
　　1 NASH相关肝纤维化小鼠肝组织中miRNAs差异表达明显，提示miRNAs可能参与了该病的发病过程。
　　2 miR-146a-5p在MCD组小鼠的肝组织中表达较正常对照组小鼠明显降低，提示miR-146a-5p可能参与了NASH相关肝纤维化的调控。
　　第二部分差异表达miRNAs的生物信息学分析及miR-146a-5p的靶基因验证
　　目的：探明差异表达miRNAs在NASH相关肝纤维化中的靶基因及其生物学分析。
　　方法：采用TargetScan、PicTar及miRanda三种常用的靶基因预测软件对差异表达的miRNAs的靶基因进行预测。Gene Ontology（GO）对靶基因集合进行 GO注释描述，同时应用 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路数据库分析差异表达miRNAs可能参与调节的信号通路。利用双荧光素报告基因系统验证miR-146a-5p与其靶基因的靶向调节关系。
　　结果：
　　1生物信息学分析：对TargetScan、PicTar及miRanda预测差异表达miRNAs的靶基因进行GO分析结果显示，差异表达miRNAs靶基因的功能显著富集于转录调控、转录酶活性、蛋白结合及磷酸化、Wnt信号通路及其负性调控等，而 KEGG信号通路分析结果显示差异表达的 miRNAs靶基因参与的信号通路显著富集于胰岛素信号通路、凋亡、Wnt信号通路、Toll样受体信号通路及mTOR信号通路等。
　　2 miR-146a-5p的靶基因预测：应用三种 miroRNA靶基因预测软件（TargetScan、PITA和miRanda）共同预测miR-146a-5p的靶基因，其中Wnt13′非编码区（3′-Untranslated Regions，3′-UTR）及Wnt5a3′-UTR均存在miR-146a-5p的结合位点。
　　3靶基因验证：双荧光素酶报告基因显示，与空白对照组相比，Wnt1基因3′-UTR野生型质粒与 miR-146a-5p模拟物（mimics）共转染293T细胞后，报告基因的荧光素酶活性显著降低，与 miR-146a-5p抑制物（inhibitor）共转染后，酶活性呈相反趋势改变。而miR-146a-5p mimics、mimics control、miR-146a-5p inhibitor、inhibitor control对Wnt1基因3′-UTR突变型质粒荧光素酶活性无明显影响。
　　4肝组织miR-146a-5p靶基因表达：NASH相关肝纤维化小鼠肝组织中miR-146a-5p靶基因Wnt1及Wnt5a蛋白较正常对照组显著增多（p<0.05），与miR-146a-5p的表达负相关。
　　结论：
　　1 NASH相关肝纤维化肝组织中差异表达的miRNAs可能通过调控多种生物学功能及信号通路而影响脂肪性肝纤维化的形成。
　　2 miR-146a-5p能与Wnt13?UTR及Wnt5a3?UTR特异性结合，提示Wnt1及Wnt5a为miR-146a-5p的靶基因。
　　第三部分 miR-146a-5p在NASH相关肝纤维化中的作用及机制研究
　　目的：深入阐明miR-146a-5p对肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）功能的调控，探明miR-146a-5p对NASH相关肝纤维化发生发展的作用。
　　方法：采用链霉蛋白酶-胶原酶远未消化肝脏，经Percoll密度梯度离心，分离小鼠原代 HSC，分别培养1d、3d、7d。采用实时定量 RT-PCR及Western blot检测原代HSC活化过程中，miR-146a-5p及靶基因的表达变化。应用肝星状细胞系 HSC-T6及 LX-2细胞，将50nM miR-146a-5p mimics及100nM inhibitor转染HSC-T6细胞，采用CCK8（Cell Counting Kit8）测定各组细胞活力，采用实时荧光定量PCR及Western-blot分析miR-146a-5p及靶基因、肝纤维化相关基因mRNA及蛋白的表达情况；同时利用siRNA技术沉默Wnt1及Wnt5a，实时荧光定量PCR及Western-blot分析miR-146a-5p及靶基因、肝纤维化相关基因mRNA及蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1 HSC活化过程中miR-146a-5p及靶基因的表达变化：在HSC培养1d、3d及7d，miR-146a-5p表达随HSC活化而逐渐降低，而靶基因Wnt1及Wnt5a的表达伴随HSC活化而逐渐增加；
　　2过表达 miR-146a-5p对 HSC增殖的影响：CCK8结果显示，转染50μM miR-146a-5p mimics后，HSC-T6的细胞活力明显降低（P<0.01）；
　　3过表达或抑制miR-146a-5p对HSC活化及分泌胶原功能的影响；过表达 miR-146a-5p能够显著抑制α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、1型胶原（Collagen Type1，Col-1）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2） mRNA及蛋白的表达，而增加Smad7 mRNA及蛋白的表达（P<0.01）；抑制miR-146a-5p的表达能够明显增加α-SMA、Col-1、MMP-2的表达，而抑制Smad7的表达（P<0.01）。
　　4过表达或抑制miR-146a-5p对HSC内靶基因Wnt1、Wnt5a及下游信号分子的影响：过表达miR-146a-5p能够明显抑制靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表达变化，而mRNA的表达无明显差异，同时其下游β-catenin、NAFT5的表达显著降低，而GSK-3β的表达显著增加；抑制miR-146a-5p能够显著增加靶基因Wnt1、Wnt5a蛋白的表达变化，而mRNA的表达无明显差异，同时其下游β-catenin、NAFT5的表达显著增加，而 GSK-3β的表达显著降低；
　　5 siRNA沉默靶基因对下游信号通路及肝纤维化相关因子的影响：分别转染si-Wnt1及si-Wnt5a后，Wnt1及Wnt5a的mRNA及蛋白表达水平显著降低，同时其下游基因β-catenin、NAFT5的表达显著降低，而GSK-3β的表达显著增加，α-SMA、Col-1、MMP-2的表达明显降低，而Smad7的表达则明显增高。
　　结论：
　　1 miR-146a-5p能够抑制HSC的增殖、活化及胶原分泌；
　　2 miR-146a-5p能够抑制HSC内靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信号通路。
　　第四部分血红素氧合酶-1靶向调控在NASH相关肝纤维化中对miR-146a-5p及靶基因的影响
　　目的：阐明靶向调控HO-1基因在NASH相关肝纤维化发病过程中对miR-146a-5p及靶基因的影响。
　　方法：采用 HO-1激动剂血晶素（Hemin）及抑制剂锌原卟啉（zinc protoporphyrin，ZnPP）腹腔注射干预NASH相关肝纤维化小鼠模型，观察小鼠血清酶学改变及肝组织炎症、脂肪变及纤维化程度；采用实时定量RT-PCR及Western blot检测HO-1诱导或抑制对 miR-146a-5p、靶基因Wnt1、Wnt5a及Wnt信号通路关键分子、肝纤维化相关因子mRNA及蛋白的表达的影响。
　　结果：
　　1 HO-1对小鼠肝脏生化学的影响：HO-1激动剂Hemin能够显著降低MCD饮食喂养小鼠血清ALT、AST水平，而HO-1抑制剂ZnPP能够进一步加重肝组织损伤，ALT、AST水平进一步增高。
　　2 HO-1对小鼠肝组织病理学的影响：肝组织病理学显示Hemin能够明显改善小鼠肝组织肝脂肪变、炎症及纤维化，而ZnPP则加重小鼠肝损伤；
　　3 HO-1对miR-146a-5p、靶基因及其下游信号通路的影响：Hemin能够明显上调miR-146a-5p表达，并下调其靶基因Wnt1、Wnt5a表达，同时调控下游信号分子β-catenin、GSK-3β及NAFT5的表达；而ZnPP能够显著下调miR-146a-5p的表达，上调Wnt1、Wnt5a、β-catenin及NAFT5的表达，而下调GSK-3β的表达。
　　结论：
　　1 HO-1能够减轻NASH相关肝纤维化肝损伤、炎症及纤维化；
　　2 HO-1能够调控miR-146a-5p及其靶基因的表达而参与NASH相关肝纤维化的发生与发展。

著录项

作者
杜静华;
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作者单位

河北医科大学;

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授予单位河北医科大学;
学科内科学
授予学位博士
导师姓名南月敏;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类肝代谢障碍;
关键词
非酒精性脂肪性肝病; 肝纤维化; 微小RNAs; 差异表达; 血红素氧合酶-1; miR-146a-5p基因; 调控机制;

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