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内皮型一氧化氮合酶的表达、微血管密度及子宫内膜血流评估子宫内膜容受性的价值

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1研究对象

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综述:内皮型一氧化氮合酶在生殖方面的相关研究进展

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摘要

目的：随着辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）日新月异的进展，试管婴儿的成功率由20％~30%增加至50%左右。能够使胚胎成功着床，起到重要作用的是子宫内膜的容受性和胚胎质量。在均j移植优质胚胎的基础上，建立良好的内膜容受性是该生理过程的重要环节。子宫内膜容受性与调节内膜血管的因子存在极密切的关系，与内膜的血液供应息息相关。促血管生成相关因子能够通过调节血管功能等方面，改善血液供应。在许多与血管生成相关的因子中，我们选择内皮型一氧化氮合酶（ endothelial Nitric Oxide Synthase eNOS）进行研究。
　　eNOS作为一种将 L精氨酸和氧气催化成一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的生物蛋白酶，对调节子宫内膜局部血供方面起着重要的作用[1]。它催化形成的产物-NO，是一种重要的多功能因子,能够调节血管阻力，参与细胞损伤修复及信号转导等，进而介导许多生理功能，发挥生物作用。eNOS在子宫内膜中的表达可能参与调节子宫内膜局部血液供应，影响子宫内膜容受性。
　　血管生成可以通过微血管密度（Microvessel Density MVD）这一指标来评价。微血管的特点是其内皮细胞能够经过 CD34抗体标记并被染色，利用这一特性，我们可以观察微血管的生成情况[2]。当组织中微血管被标记的越多时，也预示着此处新生的毛细血管数量越大，代表该处的血液供应更丰富。血流的供应可以通过彩色多普勒超声监测血流参数如搏动指数（pulsatility，PI）、阻力指数（resistance index，RI）及收缩期与舒张期血流速度比值(systolic/diastolic，S/D)来体现。
　　所以子宫内膜着床窗口期 eNOS表达、微血管密度及子宫内膜血流组成一系列评价体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transferm，IVF-ET)子宫内膜容受性的指标。
　　方法：纳入2014年8月～2015年6月初次在河北医科大学第四医院生殖医学科接受IVF助孕治疗的患者。纳入正常月经周期，年龄20-35岁，单纯为输卵管因素行IVF助孕者共计60例。收集着床窗口期子宫内膜，使用免疫组织化学技术及逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测eNOS、MVD的表达。
　　1子宫内膜采集：收集行控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)前的自然月经周期子宫内膜。首先由特定人员监测卵泡，并用半定量试纸测定尿促黄体生成素。当尿 LH≥20 IU/L时，肌注绒促性素，并记录内膜厚度及形态，当卵泡消失或体积明显缩小为排卵[3]。排卵后6~7天，使用GE Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪检测子宫内膜血流灌注、测定子宫内膜形态及血流参数RI、PI、S/D值等。由专人操作，连续测量3次并计算平均值。利用一次性内膜取样器采集着床窗口期内膜。一部分于-80℃保存，一部分存放于甲醛固定液中，取内膜后均无阴道异常出血。
　　2控制性卵巢刺激：排卵后6～7天给予注射用醋酸亮丙瑞林缓释微球(Gonadotrophin-releasing-hormone agonist， GnRH-a，中国博恩特)1.4mg，14天后达到降调节标准，使用重组人促卵泡激素α(Gonal-F, r-FSH,果纳芬，默克雪兰诺)150-225IU启动，利用超声监测子宫内膜和卵泡生长情况，并结合雌二醇（Estradiol，E2）等性激素的变化判断，当至少有2个主导卵泡直径大于20 mm时，当晚注射艾泽(重组人绒促性素α，默克雪兰诺)250μg，艾泽注射后36-37h取卵，适时向培养皿中加入精子，行IVF受精，进行胚胎培养，将培养3天的胚胎植入子宫，均移植优质胚胎2枚，移植后28天 B超见到孕囊即诊断为临床妊娠。再根据临床妊娠与否分为妊娠组与非妊娠组。其中妊娠组（n=30例），未妊娠组（n=30例）。
　　3 RT-PCR：测定子宫内膜中eNOS mRNA的表达。首先提取总RNA。加入TriQuick总RNA提取试剂，将子宫内膜组织放在冰盒上研磨，各取实验组和对照组等量子宫内膜组织，并加入Rezol1 ml，放置于匀浆器内充分匀浆，提取总 RNA，再进行反转录得到cDNA，继续进行 PCR扩增。扩增片段长度为340bp，同时以扩增内参照片段长度为605bp的GAPDH。PCR循环条件为：PCR扩增条件:95℃10 min1循环,(94℃45 s,54℃30 s,72℃50 s)35个循环,72℃延伸7 min,4℃保温。PCR扩增后的产物利用2%琼脂糖凝胶，行电泳后，利用gel-proanalysis3.1图像分析系统，进行图像分析及照相。利用内参值校正IOD值，将校正后的值进行统计学分析。
　　4免疫组化检测:使用4%甲醛固定子宫内膜后进行石蜡包埋，制成约4μm厚连续性组织切片。分别进行HE和 SP法免疫组化染色。经过脱蜡、高压热抗原修复、封闭、加入多克隆兔抗人 eNOS(稀释浓度为1:100)、加入二抗、利用DAB染料进行显色、再利用苏木素染料重新染色、经过酒精脱水后变透明、再用中性树胶进行封片。利用 PBS作为阴性对照代替一抗。显微镜观察并拍照。MVD判断标准使用兔抗人 CD34染色，稀释浓度为1∶100，采用免疫组化SP法，余步骤同前。依据 Weidner判断标准，计数MVD。
　　5统计学方法统计学处理数据均利用SPSS13.0统计软件对所有数据进行统计分析。计量资料采用((-x)±s)表示，组间差异采用 t检验;等级资料利用秩和检验，以α=0.05为检验标准，当 P＜0.05时为差异有统计学意义。两变量相关性分析采用Spearman秩相关分析，当P＜0.05时为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1 IVF妊娠组(n=30)及未妊娠组(n=30)年龄、不育年限、bFSH(基础促卵泡生成素)、BMI（体重指数）、Gn天数，Gn用量、获卵数等比较差异均无统计学意义。
　　2 IVF妊娠组子宫内膜着床窗口期 eNOSmRNA的表达明显高于未妊娠组，eNOSmRNA妊娠组的表达为(0.72±0.21)，对照组的表达(0.29±0.12)，两组比较具有统计学差异。
　　3 eNOS在妊娠组及未妊娠组腺体上皮细胞和基质细胞均有表达。IVF妊娠组(n=30)，“－”表达1例，“+“表达5例，“++”表达12例，“+++”表达12例。IVF未妊娠组(n=30),“－”表达12例，“+”表达14例，“++”表达2例，“+++”表达2例，p<0.05,比较具有统计学差异。
　　4 MVD计数妊娠组计数14.53±3.28,未妊娠组12.20±3.83，P<0.05，两组比较具有统计学差异。
　　5 eNOS的表达与MVD的相关性分析经Spearman秩相关分析，子宫内膜eNOS表达水平与 MVD计数水平呈正相关（r=0.814，P<0.05），具有统计学差异。
　　6妊娠组子宫内膜血流搏动指数PI、阻力指数RI、S/D比值均低于非妊娠组，具有统计学差异。妊娠组内膜血流较未妊娠组丰富。
　　结论：
　　1妊娠组着床窗口期eNOSmRNA及蛋白的表达升高，证实了eNOS有助于提高子宫内膜容受性，增加IVF胚胎着床机会，为子宫内膜容受性相关因子之一。
　　2妊娠组MVD计数增加，证实了MVD增加有助于提高子宫内膜容受性；
　　3 eNOS组化评分与MVD计数具有正相关性，推断eNOS与子宫内膜血流的形成密切相关。
　　4妊娠组子宫内膜PI、RI、S/D低于非妊娠组，血液供应也较未妊娠组丰富。得出血流丰富程度与妊娠结局息息相关。

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