小鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及纯化及其对环磷酰胺引起的急性肾损伤的修复作用

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目的：
　　1.分离并大量培养能够稳定传代的小鼠脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)，对其生物学特点进行描述及鉴定；
　　2.应用差速贴壁法对所培养的小鼠ADSCs进行纯化，获得高纯度的ADSCs；
　　3.探究ADSCs对环磷酰胺引起的急性肾损伤的修复作用。
　　方法：
　　1.在无菌环境下分离提取小鼠腹股沟区脂肪组织，应用眼科剪将其剪碎至1mm3小组织块，应用 I型胶原酶及胰蛋白酶对其进行消化，制成单细胞悬液，按照一定细胞浓度分装于若干培养瓶中，加入适量含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基于标准环境下进行培养，定期换液，观察原代细胞形态并拍照。
　　2.待原代细胞爬满培养瓶底80%以上时，对其进行传代培养，取第3代对数生长期细胞进行冻存及复苏，探究其生物活性。
　　3.验证成功培养的第3代细胞的生物学特性，包括应用MTT法绘制其生长曲线、通过加入含有地塞米松0.1umol/L，维生素 C50umol/L，β-甘油磷酸钠10mmol/L，胎牛血清10%的成骨诱导培养基，诱导其向成骨细胞分化，加入含有地塞米松10umol/L，胰岛素10umol/L，吲哚美辛200umol/L，IBMX500umol/L，胎牛血清10%的成脂诱导培养基，诱导其向脂肪细胞分化，探究其多分化潜能，应用流式细胞术方法验证其表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达情况。
　　4.应用差速贴壁法对所培养细胞进行提纯，应用FCM方法检测差速贴壁法培养组及普通培养法培养组细胞表面CD44表达率，并进行统计学分析。
　　5.取balb/c小鼠27只，随机分为3组，分别命名为A空白对照组、B模型对照组及C模型实验组，于d-1天，分别给予B、C组小鼠腹腔注射环磷酰胺，环磷酰胺浓度为10mg/ml，每只小鼠环磷酰胺用量为200mg/Kg，即每只小鼠需要注入10mg/ml环磷酰胺量为V=20m，于d0天给予B组小鼠尾静脉注射生理盐水0.2ml，C组小鼠尾静脉注射ADSCs0.2ml，细胞数量约为1×106，分别于d1、d3、d7应用眼眶取血法取小鼠静脉血，检测血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL，又名载脂蛋白-2）水平，并留取肾脏组织，做肾脏病理及HE染色，根据国际通用急性肾小管坏死程度的评分方法，对环磷酰胺引起的急性肾损伤进行评分，对以上数据进行统计学分析。
　　结果：
　　1.成功从小鼠腹股沟区脂肪细胞培养出脂肪间充质干细胞，细胞呈梭形，聚集、漩涡状生长，在第2、3代具有较强生长能力，适于进行科学研究，4代以后细胞仍可传代，但是细胞形态较前有差异，细胞呈网状或铺路石样，在本实验培养条件下，最多培养10代后，细胞增殖活性明显降低；
　　2.成功诱导ADSCs分化为成骨细胞及脂肪细胞，经茜素红染色、油红O染色证实，细胞成功分化为成骨细胞及脂肪细胞，所培养ADSCs具有多分化潜能；
　　3.小鼠脂肪间充质干细胞阳性表达 CD29、CD44，不表达 CD34、CD45；
　　4.应用差速贴壁法所提纯细胞CD44表达率为72%，普通培养组CD44表达率为55%，两种培养方法具有显著差别（P＜0.05），应用差速贴壁法可培养出较高纯度的ADSCs；
　　5.治疗第1天及第3天可见模型对照组、模型实验组及空白对照组相比，病理形态未见明显差别，镜下均可见较清晰肾小球结构，肾小管排列规则，细胞排列较致密，而第7天所见模型对照组肾小球结构稍有破坏，肾小球中细胞排列紊乱，肾小管变形，细胞核排列疏松，模型实验组相对于模型对照组来说，结构稍有好转，对其肾脏病理评分进行统计学分析，二组无统计学意义，只提示稍有差别，但所取3个时间段模型实验组NGAL水平均较模型对照组显著降低（P＜0.05），第3天及第7天BUN及Scr水平较模型对照组显著降低（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.成功分离、培养出了小鼠ADSCs，在本实验条件下可稳定传代至少7代，符合ADSCs形态学特点，具有多分化潜能，能够阳性表达CD29、CD44，不表达CD34、CD45，与已有研究成果一致。
　　2.应用差速贴壁法成功培养出更高纯度的小鼠ADSCs。
　　3.ADSCs对环磷酰胺引起的急性肾损伤有一定修复作用。

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作者
杜红蕾;
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作者单位

河北医科大学;

展开▼
授予单位河北医科大学;
学科内科学
授予学位硕士
导师姓名罗建民;
年度 2016
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类化学（药物）疗法;骨髓移植;
关键词
脂肪间充质干细胞; 差速贴壁法; 分离纯化; 环磷酰胺; 急性肾损伤; 肾修复作用; 干细胞治疗;

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