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慢性脑低灌注状态大鼠脑组织线粒体结构和功能改变及丁苯酞注射液对其影响

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综述 线粒体与脑缺血

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摘要

目的：血管性痴呆（vascular dementia VD）已经成为中老年人群中的常见病、多发病。VD突出的临床特点是学习、记忆等认知功能下降，伴或不伴神经功能缺损的症状和体征。目前，血管性痴呆的发病机制尚未完全明确，治疗也仍以控制病情、对症治疗、加强护理为主，尚无特殊有效的根治方法。因此，探索VD的发病机理，制定合理的治疗方案，是医学领域研究的重要课题。VD病因之一可能与慢性低灌注状态所造成的脑缺血缺氧有关。所谓慢性脑低灌注状态是高血压、脑动脉硬化引起的脑动脉狭窄所致的脑组织长期低于生理阈值而出现的慢性缺血性神经系统损害的一种病理状态，是VD、AD（Alzheimer's disease AD）和Binswanger病等多种疾病发展过程中的一个共同病理过程。
　　 大量研究表明，在低灌注状态及低代谢状态下认知功能可发生减退，而脑部自由基代谢的紊乱是低灌注时产生脑实质和脑微血管系统损害的重要的可能机制。线粒体既是机体产生氧自由基的主要细胞器，又是细胞进行能量代谢的主要场所。线粒体内部结构是氧自由基损伤的首要目标。因此，线粒体结构和功能的异常可能在VD的发病过程中起关键性作用。
　　 近年来，临床上有关使用丁基苯酞对脑缺血具有神经保护作用，已引起了人们广泛关注。丁基苯（dl-n-butylphthalide d1-NBP）是源于天然的化学合成药物，药理学实验表明有良好的抗脑缺血和脑保护作用，尤其是对急性局灶性缺血后脑神经元线粒体形态和功能具有保护作用。目前，有关丁基苯酞神经保护作用的大部分研究都集中在急性缺血模型，有关作用于慢性脑低灌注模型的实验研究报道尚缺乏。本实验通过能较好模拟人类慢性脑低灌注的结扎大鼠双侧颈总动脉的动物模型，通过水迷宫试验测试大鼠学习记忆受损情况，行透射电镜观察线粒体形态变化，用分光光度法测定大鼠脑线粒体ATP酶活性，超氧化物岐化酶（superoxide dismutase SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde MDA）含量，并探讨丁苯酞注射对其影响的药理机制，以期能为临床治疗血管性认知功能障碍提供一个新思路。
　　 方法：用雄性SD大鼠55只，月龄3～4个月，起始体重280～340g，随机分为假手术对照组（n=10），生理盐水对照组（n=15），丁苯酞注射液高剂量组（n=15），丁苯酞注射液低剂量组（n=15）。每组大鼠行双侧颈总动脉永久结扎术，假手术组大鼠除不结扎双侧颈总动脉外，余处理同生理盐水组和丁苯酞注射液组。丁苯酞注射液高剂量组手术第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，（剂量6mg/kg），每日二次。丁苯酞注射液低剂量组手术第4周后腹腔注射丁苯酞注射液，（剂量2mg/kg），每日二次。生理盐水组腹腔注射等剂量生理盐水，假手术组不给药，连续给予四周。各组大鼠在水迷宫测试后，随机各取2只，1％的戊巴比妥钠麻醉后，立即断头在冰盘上快速取脑，取一侧颞叶皮层约1mm×1mm×2 mm，放入磷酸缓冲的4％戊二醛溶液固定，1％锇酸中后固定，脱水透明，环氧树脂包埋，超薄切片，电镜观察、照相。末次给药后，动物均禁食12h，断头，在冰盘上快速取脑，提取线粒体，并悬浮于EDTA-蔗糖Tris-HCl缓冲液中。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。调节蛋白含量至1mg/ml。分别测定Na+-K+-ATP酶活力、SOD活力和MDA含量。运用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD-t检验进行各组间的两两比较，P<0.05表示有统计学意义。
　　 结果：（1）各组大鼠存活情况：假手术组死亡0只，生理盐水组死亡5只，死亡率为33.3％。丁苯酞注射液低剂量组、丁苯酞注射液高剂量组分别死亡4只、5只，死亡率分别为26.7％和33.3％。各组存活大鼠作为研究对象。（2）水迷宫试验：生理盐水组大鼠学习、记忆成绩显著下降，表现为寻找平台潜伏期时间延长，明显高于假手术组（p<0.05）。丁苯酞注射液低剂量组、丁苯酞注射液高剂量组分别与生理盐水组比较，学习、记忆成绩均显著改善（p<0.05）。丁苯酞注射液低剂量组、丁苯酞注射液高剂量组分别与与假手术组比较，学习、记忆成绩均有所下降，但无显著性差异（P>0.05）。丁苯酞注射液高剂量组与丁苯酞注射液低剂量组相比学习、记忆成绩无明显差别（p>0.05）。（3）线粒体超微结构改变：假手术组线粒体超微结构清楚，无明显异常改变。生理盐水组线粒体大部分嵴融合消失，线粒体水肿，有的线粒体双层单位膜消失，粗面内质网脱颗粒，神经元胞质水肿，细胞器明显减少。丁苯酞注射液高剂量组线粒体接近于正常，未见线粒体嵴断裂、空泡增多等，有的出现粗面内质网腔扩大、线粒体肥大等可逆性损伤。丁苯酞注射液低剂量组线粒体形态基本规则，大多数嵴完整，排列紧密规律。（4）线粒体ATP酶活性测定结果情况：与假手术组相比，生理盐水组线粒体ATP酶活性明显下降（p<0.05）。与生理盐组相比，丁苯酞注射液低剂量组线粒体ATP酶活性显著增加（p<0.05）。与生理盐水组相比，丁苯酞注射液高剂量组线粒体ATP酶活性亦显著增加（p<0.05）。丁苯酞注射液低剂量组与丁苯酞注射液高剂量组相比ATP酶活性无明显差异（p>0.05）。（5）SOD、MDA测定结果情况：与假手术组相比，生理盐水组线粒体SOD活力下降，MDA含量增加（p<0.05）。与生理盐水组相比丁苯酞注射液低剂量组SOD活力有所增加，MDA含量有所下降（p<0.05）。与生理盐水组相比，丁苯酞注射液高剂量组SOD活力明显增加，MDA含量明显下降（p<0.01）。与丁苯酞注射液低剂量组相比，丁苯酞注射液高剂量组SOD活力，MDA含量均无明显差异（p>0.05）。
　　 结论：（1）本实验采用双侧颈总动脉永久性结扎成功复制慢性脑低灌注大鼠模型（occlusion of bilateral2-VO），水迷宫试验证实了模型大鼠学习和记忆能力下降，进一步证实模型可靠，透射电镜观察可见大鼠神经元线粒体超微结构有明显改变。（2）慢性脑低灌注大鼠线粒体SOD活性下降，MDA含量增高，提示线粒体氧化损伤可能是VD的发病机制之一。（3）慢性脑低灌注大鼠线粒体ATP酶活性下降。提示能量代谢障碍可能是VD的发病机制之一。（4）通过丁苯酞注射液治疗，慢性脑低灌注大鼠学习记忆能力明显高于对照组，病理学进一步证实可减轻线粒体超微结构损伤程度。与对照组比较，经丁苯酞注射液治疗后慢性脑低灌注大鼠海马线粒体SOD活性增高，MDA含量降低，ATP酶活性增高。提示丁苯酞注射液对慢性脑低灌注状态大鼠脑组织线粒体结构和功能具有保护作用。为临床治疗血管性痴呆提供一个新思路。

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